Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo
概要
Presentiamo un approccio per purificare l’mRNA legato al ribosoma dalle cellule endoteliali vascolari (EC) direttamente nel cervello del topo, nei polmoni e nei tessuti cardiaci attraverso il tag genetico specifico della Proteina di fluorescenza verde avanzata (EGFP) nei ribosomi in combinazione con la purificazione dell’RNA .
Abstract
Molti studi si sono limitati all’utilizzo di saggi cellulari in vitro e tessuti interi o all’isolamento di specifici tipi di cellule da animali per l’analisi in vitro del trascrittoma e dell’espressione genica mediante qPCR e sequenziamento dell’RNA. Il trascrittoma completo e l’analisi dell’espressione genica di specifici tipi di cellule in tessuti e organi complessi sarà fondamentale per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari con cui i geni sono regolati e la loro associazione con l’omeostasi dei tessuti e l’organo Funzioni. In questo articolo, dimostriamo la metodologia per l’isolamento dell’RNA legato al ribosoma direttamente in vivo nell’endotelio vascolare dei polmoni animali come esempio. Saranno descritti i materiali e le procedure specifici per la lavorazione dei tessuti e la purificazione dell’RNA, compresa la valutazione della qualità e della resa dell’RNA, nonché qPCR in tempo reale per i saggi genici arteriogenici. Questo approccio, noto come tecnica di purificazione dell’affinità ribosomiana (TRAP), può essere utilizzato per la caratterizzazione dell’espressione genica e l’analisi del trascrittoma di alcuni tipi di cellule direttamente in vivo in qualsiasi tipo specifico nei tessuti complessi.
Introduction
Nei tessuti complessi come il cervello, il cuore e il polmone dei mammiferi, gli alti livelli di eterogeneità cellulare complicano l’analisi dei dati di espressione genica derivati da campioni di tessuto intero. Per osservare i profili di espressione genica in un particolare tipo di cellula in vivo, recentemente è stata sviluppata una nuova metodologia, che consente l’interrogatorio dell’intero complemento di mRNA tradotto di qualsiasi tipo di cellula geneticamente definita. Questa metodologia è nota come tecnica di purificazione dell’affinità del ribosoma di traduzione (TRAP)1,2. È uno strumento utile per studiare la biologia endoteliale e l’angiogenesi quando combinato con la manipolazione genetica di altri geni associati all’angiogenesi negli animali.
Abbiamo dimostrato che la segnalazione angiogenica del PKD-1 e la trascrizione del gene angiogenico CD36 sono fondamentali per la differenziazione delle cellule endoteliali (EC) e l’angiogenesi funzionale3,4,5,6. Per determinare i meccanismi molecolari della segnalazione angiogenica e metabolica nella trascrizione genica e nella trasdifferenza EC, abbiamo creato topi TRAP geneticamente ingegnerizzati con geni angiogenici specificamente eliminati sulla base della tecnica TRAP1 , 2. Inoltre, nei nostri animali TRAP, non solo hanno pkd-1 o cd36 carenza genica nell’endotelio vascolare o deduzione globale del gene cd36, ma una proteina di fluorescenza verde migliorata (EGFP) è anche geneticamente etichettata su La CE sta traducendo i ribosomi. Il TRAP consente la purificazione dell’affinità dell’mRNA legato al ribosoma direttamente dall’endotelia vascolare dei tessuti mirati, consentendo l’analisi dell’espressione genica e l’identificazione di nuovi trascrittomi associati alla differenziazione e angiogenesi direttamente in condizioni in vivo. Abbiamo isolato con successo l’RNA legato al ribosoma dagli endoti in questi animali geneticamente modificati. L’RNA purificato può essere utilizzato per un’ulteriore caratterizzazione dei geni angiogenici o arteriogenici nella regolazione della differenziazione e delle funzioni CE. Questo protocollo fornisce una guida passo-passo per implementare l’approccio TRAP per l’isolamento dell’mRNA in EC direttamente in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’angiogenesi è un complesso processo a più fasi, in cui la trascrizione e l’espressione genica angiogenica specifica della CE svolgono un ruolo essenziale nella differenziazione CE e nella riprogrammazione angiogenica3,4. Per superare le barriere della diversità cellulare e della complessità architettonica per comprendere meglio la funzione del sistema vascolare dei mammiferi a livello molecolare in vivo, abbiamo creato topi TRAP specifici per eC, accompagna…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro del dottor Ren è sostenuto dall’American Heart Association (13SDG14800019; BR), ann’s Hope Foundation (FP00011709; BR), l’American Cancer Society (86-004-26; il MCW Cancer Center to BR), e il National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer è supportato dal 2018 MCW CTSI 500 Stars Internship Program; P. Moran è supportato da una borsa di studio institutional research Training di NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
参考文献
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
