生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳
概要
我々は、RNA精製と組み合わせてリボソーム中の増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)のEC特異的遺伝的タグを介して、マウス脳、肺および心臓組織における血管内皮細胞(EC)からリボソーム結合mRNAを精製するアプローチを提示する。.
Abstract
多くの研究は、qPCRおよびRNAシーケンシングによる転写物および遺伝子発現のインビトロ分析のために、インビトロ細胞アッセイおよび全組織または動物からの特定の細胞型の単離に限定されている。複雑な組織や臓器における特定の細胞型の包括的な転写物および遺伝子発現解析は、遺伝子が調節される細胞および分子機構と組織恒常性および器官との関連を理解するために重要である。関数。本稿では、動物肺の血管内皮におけるリボソーム結合RNAを生体内で直接単離する方法論を例として示す。組織処理およびRNA精製のための具体的な材料および手順について説明し、RNAの品質と収量の評価、ならびに動脈系遺伝子アッセイのためのリアルタイムqPCRを含む。このアプローチは、リボソーム親和性精製(TRAP)技術の翻訳として知られており、複雑な組織における任意の特定のタイプの生体内で直接生体内の特定の細胞タイプの遺伝子発現およびトランスクリプトーム分析の特性評価に利用することができる。
Introduction
哺乳類の脳、心臓、肺などの複雑な組織では、細胞の不均一性の高いレベルは、組織サンプル全体から得られる遺伝子発現データの分析を複雑にします。生体内の特定の細胞型における遺伝子発現プロファイルを観察するために、最近新しい方法論が開発され、遺伝子決定された任意の細胞型の翻訳されたmRNA補体全体の尋問が可能になった。この方法論は、翻訳リボソーム親和性精製(TRAP)技術1、2として知られている。これは、動物の他の血管新生関連遺伝子を遺伝的に操作する場合、内皮細胞生物学と血管新生を研究するのに有用なツールです。
血管新生PKD-1シグナル伝達および血管新生遺伝子CD36の転写は、内皮細胞(EC)分化および機能血管新生3、4、5、6に重要であることを示した。遺伝子転写およびECトランス分化における血管新生および代謝シグナル伝達の分子機構を決定するために、TRAP技術1に基づいて特異的に削除された血管新生遺伝子を用いた遺伝子組み換えTRAPマウスを作成した。,2.さらに、TRAP動物では、血管内皮またはcd36遺伝子の世界的な欠失にpkd-1またはcd36遺伝子欠損があるだけでなく、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)も遺伝的にタグ付けされています。ECのリボソームの翻訳TRAPは、標的組織の血管内皮から直接リボソーム結合mRNAの親和性精製を可能にし、遺伝子発現の解析とEC分化に関連する新しい転写物の同定を可能にし、生体内条件下で直接血管新生。これらの遺伝子組み換え動物では、内皮からリボソーム結合RNAを単離することに成功しました。精製されたRNAは、EC分化および機能の調節における血管新生または動脈系遺伝子のさらなる特徴付けに使用することができる。このプロトコルは、生体内で直接IC内のmRNAを単離するためのTRAPアプローチを実装するためのステップバイステップガイドを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
血管新生は、EC特異的血管新生遺伝子転写および発現がEC分化および血管新生リプログラミング3、4において重要な役割を果たす複雑な多段階プロセスである。細胞の多様性と建築の複雑さから、生体内の分子レベルで哺乳類血管系の機能をよりよく理解するために、EC特異的なCD36を伴うEC特異的TRAPマウスを作成しました。 、EC特異的pkd-1</…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
レン博士の研究は、アメリカ心臓協会(13SDG14800019;)BR)、アンの希望財団(FP00011709;BR)、米国癌学会(86-004-26;BRへのMCW癌センター)、および国立衛生研究所(HL136423);BR);ジョーダン・パーマーは、2018年MCW CTSI 500スターインターンシッププログラムによってサポートされています。P.モランは、NHLBI(5T35 HL072483-34)からの機関研究訓練助成金によってサポートされています。
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
参考文献
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
