Die Mikroumgebung von Tumoren ist ein wesentlicher Bestandteil des Krebswachstums und-einmarsches. Um die Fortschreibung des Karzinoms zu imitieren, wird eine biologisch relevante menschliche Matrix benötigt. Dieses Protokoll führt eine Verbesserung für den in vitro dreidimensionalen spheroizider Invasionsuntergang ein, indem es eine menschliche, auf Gelotem basierende Matrix verwendet. Das Protokoll führt auch eine computergestützte Zellinvasion ein.
In der In-vitro-Krebs-Forschung werden häufig zweidimensionale zellkulturbasierte Assays eingesetzt. Allerdings fehlen ihnen mehrere Grundelemente, die die Tumormikroumgebung bilden. Um zuverlässigere In-vitro-Ergebnisse zu erhalten, wurden mehrere dreidimensionale (3D) Zellkultur-Assays eingeführt. Diese Assays ermöglichen es Krebszellen, mit der extrazellulären Matrix zu interagieren. Diese Interaktion beeinflusst das Zellverhalten, wie etwa die Proliferation und Invasion, sowie die Zellmorphologie. Zusätzlich könnte diese Interaktion den Ausdruck mehrerer pro-und antitumorigener Moleküle auslösen oder unterdrücken. Spheroid-Invasionsuntersuchung wurde entwickelt, um eine geeignete 3D-In-vitro-Methode zur Untersuchung der Krebszellinfall zu bieten. Derzeit werden tierisch abgeleitete Matrizen, wie zum Beispiel Maus-Sarkom-abgeleitete Matrix (MSDM) und Rattenschwanz-Typ I Kollagen, hauptsächlich in den spheroiden Invasionsuntersuchungen verwendet. Unter Berücksichtigung der Unterschiede zwischen der menschlichen Tumormikroumgebung und tierischen Matrizen wurde eine menschliche, myoma-abgeleitete Matrix (HMDM) aus gutartigem Gebärmutterleiomgewebe entwickelt. Es hat sich gezeigt, dass HMDM die Migration und Invasion von Karzinomzellen besser bewirkt als MSDM. Dieses Protokoll lieferte einen einfachen, reproduzierbaren und zuverlässigen 3D-menschlichen Tumor-basierten Spheroin-Invasionsuntergang mit der HMDM/Fibrin-Matrix. Es enthält auch detaillierte Anweisungen zur Bildgebung und-analyse. Die Spheroide wachsen in einer U-förmigen ultraniedrigen Befestigungsplatte innerhalb der HMDM/fibrin-Matrix und dringen durch sie ein. Die Invasion wird täglich mit Hilfe von ilastik und Fidschi ImageJ Software abgebildet, gemessen und analysiert. Die Assay-Plattform wurde mit Hilfe von menschlichen Kehlkopf-Primär-und metastasierenden Plattenepithelkarzinomzelllinien demonstriert. Das Protokoll eignet sich aber auch für andere feste Krebszelllinien.
Konventionelle zweidimensionale (2D) Zellkulturstudien haben wesentlich zur Krebsforschung beigetragen. Derzeit bewegen sich die Forscher eher in Richtung dreidimensionaler (3D) Zellkultur, um die in-vivo-Bedingungen besser nachzuahmen. Die 3D-Krebszellkultur reflektiert die komplexe Tumormikroumgebung in Bezug auf Zell-und Zellmatrix-Wechselwirkungen, Genexpressionsprofile, Medikamentenempfindlichkeitund Signalweg-Aktivität 2,3.
In der Krebsforschung werden mehrere 3D-Zellkulturmodelle eingesetzt, wie Tumorgewebeforscher, Tumor auf einem Chip und multizelluläre Tumorspheroide3,4. Multikelluläre Tumorspheroide sind heute weit verbreitet, da sie mehrere Merkmale der in vivo Bedingungen bei menschlichen Tumoren 1,5imitieren. Wenn der Kugeldurchmesser größer als 500 μm ist, hat er sogar hypoxische Regionen und ein nekrotisches Zentrum, das somit die in vivo tumor Situation2darstellt.
Viele synthetische (z.B. Polydimethylsiloxan) und tierabgeleitete (z.B.Rattenschwanz-TypI Kollagen und Maus-Sarkom-abgeleitete Matrix, Matrigel, genannt MSDM) wurden für 3D-Zellkultur Assays 3, 6 entwickelt, 7,8. Bisher stammt keine der kommerziell erhältlichen Matrizen aus menschlichem Tumorgewebe. Daher fehlen ihnen die Merkmale der menschlichen Tumormikroumgebung, die erhebliche Auswirkungen auf die Prozesse der Krebszellen hat8.
Myogel (menschliche Myoma-abgeleitete Matrix, genannt HMDM) wird aus dem menschlichen Gebärmutter-Kärteryomyomomomyom-Tumorgewebe 9 extrahiert. Es hat sich gezeigt, dass sich der Proteingehalt von HMDM deutlich von dem von MSDM unterscheidet. Tatsächlich unterscheiden sich 66% der HMDM-Proteine von MSDM-Proteinen. Auf der anderen Seite sind in beiden Matrizen 10 Proteine wie Laminin, Typ-IV-Kollagen, Heparansulfat-Proteoglykane, Nidogen und epidermale Wachstumsfaktor vorhanden. Darüber hinaus unterscheidet sich die Maus vom Menschen im Enzym-Gehalt, wobei Menschen 78 weniger Proteasen haben als Mäuse 11.
Fibrin wurde allein oder in Kombination mit anderen Materialien als Gerüst 12 verwendet. In der 3D-Zellkultur werden die kommerziell erhältlichen menschlichen Fibrinogen und Thrombin zu einem Fibrin-Hydrogel12kombiniert.
Dieses Protokoll beschreibt eine Verbesserung der zuvor eingeführten 3D-Tumor-Spheroid-Invasion Assay7. Dieses neue Protokoll wendet menschliche Tumor-abgeleitete Matrix anstelle von Maus-abgeleiteter Tumormatrix an. Dazu gehören auch bildgebende und Analysetechniken mit Hilfe von ilastik und Fidschi ImageJ Software. Dieses Protokoll könnte für Spheroid-Test von mehreren verschiedenen Festkörperkörperspelinien verwendet werden. Es bietet ein biologisch relevantes Werkzeug, um neuartige Krebstherapien zu entwickeln und die Auswirkungen bestimmter Moleküle auf die Invasion von Krebszellen zu untersuchen.
Die vorgestellte Methode bietet einen 3D-menschlichen Tumor-basierten Assay, um die Invasivität von Krebszellen innerhalb der menschlichen Tumormikroumgebung imitierenden Matrix zu bewerten. Die Invasion von Krebszellen lässt sich leicht messen, indem man täglich mit einem Standard-Mikroskop abilmt und durch die Verwendung von Bildanalyse-Software. Die Methode demonstriert eher die Zellinvasion als nur die Proliferation.
Im Gegensatz zu MSDM benötigt die HMDM/fibrin-Matrix keine Temperaturregelung. Diese Methode ist leicht durchzuführen, insbesondere ohne die Notwendigkeit, die Spheroide von einer Platte auf eine andere zu übertragen. Es hat nur einen technisch sensiblen Schritt, die Zugabe von Fibrinogen in die Matrix. Da Fibrinogen nach wenigen Minuten zu Glatzen beginnen, erfordert das Hinzufügen von Fibrinogen eine robuste Pipettierung und Behandlung von nur wenigen Brunnen gleichzeitig. Es besteht auch die Gefahr, dass der Spheroid gestört wird und ihn von seiner zentralen Position in den U-förmigen Brunnen bewegt wird, wenn Pipettieren hochdruckfreundlich erfolgt. Die Verzierung des Wirbelsäule kann die Bildgebung und schließlich die Analyse erschweren.
Der Test kann durch eine Änderung der Konzentration von HMDM oder Fibrinogen verändert werden. Die Zellen können auch für spätere molekulare Studien fixiert und gebeizt werden. Auch wenn diese Methode in vollautomatischer Form modifiziert werden kann, kann sie auch mit einem normalen Mikroskop und zwei Open-Source-Software durchgeführt werden, ohne dass teure Geräte benötigt werden.
Im Vergleich zu den herkömmlichen MSM-basierten 3D-Assays könnte dieser Test die Eigenschaften der Zellinvasion besser darstellen. Spheroide, die in einer kellerhaltigen, laminininhaltigen Matrix wie MSDM angebaut werden, könnten eine größere Vermehrung von Krebszellen haben als die tatsächliche Invasion, wodurch sie aufgrund ihrer geringen Einfallsfähigkeit für Invasionsuntersuchungen in mehreren Krebszelllinien ungeeignet ist. Eine andere häufig verwendete Matrix, Typ I-Collagen, neigt dazu, während des 3D-Anbaus von den Rändern zu schrumpfen, was die Lokalisierung und Abbildung der Brunnen durch die Spheroid beeinflusst. Darüber hinaus wurden die Unterschiede zwischen den intrinsischen invasiven Eigenschaften der mehr (HSC-3) und weniger (SCC-25) aggressiven Zungenkarzinomzelllinien anhand von menschlichen Tumormikrokörper-Mimitierungsmodellen nachgewiesen (Myomscheiben und seine lösliche Form). Matrix)10,13.
Der Test ist auch ethischer als die Verwendung von MSDM, da HMDM aus dem übrig gebliebenen Material des menschlichen Leiomyomtumors gewonnen wird. Derzeit ist HMDM das einzige von Menschentoren abgeleitete ECM-Produkt, das für viele krebsbezogene In-vitro-Assays 8,10geeignetzu sein scheint. In Zukunft könnten tierisch gewebte Matrizen durch menschliche tumorbasierte Matrizen ersetzt werden, um die Notwendigkeit zu verringern, Tiere für die Matrixproduktion zu opfern.
Der Austausch von 2D-Zellkultur-Assays durch 3D-Methoden liefert genauere Informationen über das Verhalten von Krebszellen. Derzeit gibt es mehrere 3D-Modelle und kommerzielle Matrizen, aber leider sind keines für alle Krebszelllinien geeignet. Die Forscher sollten die für ihren speziellen Test am besten geeignete Matrix auswählen. Eine optimale Abstimmung von Test und Matrix kann eine Herausforderung sein, aber die Zuverlässigkeit der Ergebnisse deutlich erhöhen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken den Geldgebern dieser Studie: Der Sigrid Jusélius Stiftung, der Krebsgesellschaft Finnlands und den Forschungsmitteln des Zentralklinikums Helsinki. Die Autoren zeichnen die Biomedicum Imaging Unit der Universität Helsinki für technische Hilfe aus.
Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56°C in waterbath before use. |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H₂O. Warm the H₂O and the fibrinogen to 37°C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70°C should be thawed in a water bath maintained at 37°C. |
Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
Myogel | Lab made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |