Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

S. aureus resistente alla meticolina (MRSA) è la causa principale dell’infezione associata all’assistenza sanitaria e la resistenza agli antibiotici associata è una sfida clinica considerevole^1,2,3. Pertanto, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche è una priorità assoluta. Una promettente strategia di trattamento per gli agenti patogeni Gram-positivi sta inibendo la sintesi degli acidi grassi, un requisito per la produzione di fosforidi di membrana che, in S. aureus, include fosfatidylglycerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina⁴. Nei batteri, la produzione di acidi grassi avviene attraverso la via di sintesi degli acidi grassi II (FASII)⁵, che è notevolmente diversa dalla controparte eucatriste, rendendoI un obiettivo attraente per lo sviluppo antibiotico^5,6 . Gli inibitori del FASII si rivolgono principalmente a FabI, un enzima necessario per l’allungamento della catena del carbonio dell’acido grasso⁷. L’inibitore FabI triclosan è ampiamente utilizzato nei beni di consumo e medici^8,9. Ulteriori inibitori FabI sono in fase di sviluppo da diverse aziende farmaceutiche per il trattamento di S. aureus infezione^{10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26}. Tuttavia, molti patogeni Gram-positivi, tra cui S. aureus, sono in grado di raccogliere acidi grassi esogeni per la sintesi fosforolipidi, bypassando l’inibizione del FASII^27,28,29. Così, il potenziale clinico degli inibitori del FASII è discusso a causa di notevoli lacune nella nostra conoscenza delle fonti di acidi grassi ospiti e dei meccanismi con cui gli agenti patogeni estraggono gli acidi grassi dall’ospite^27,28. Per colmare queste lacune, abbiamo sviluppato un metodo di analisi lipidomica imparziale per monitorare l’incorporazione di acido grasso esogeno dalle particelle di lipoproteina in fosfolipidi della membrana di S. aureus.

Durante la sepsi, le particelle di lipoproteina ospite rappresentano una potenziale fonte di acidi grassi derivati dall’ospite all’interno della vascolatura, poiché la maggior parte degli acidi grassi ospiti sono associati alle particelle³⁰. Le lipoproteine sono costituite da un guscio idrofilo composto da fosfolipidi e proteine che racchiudono un nucleo idrofobico di trigliceridi e esteri di colesterolo³¹. Quattro classi principali di lipoproteine – chylomicron, lipoproteina a bassissima densità, lipoproteina ad alta densità e lipoproteina a bassa densità (LDL) – sono prodotte dall’ospite e funzionano come veicoli di trasporto lipidico, fornendo acidi grassi e colesterolo da e verso cellule ospiti attraverso la vascolatura. I LDL sono abbondanti in acidi grassi esterificati tra cui trigliceridi e tende di colesterolo^{31 .} Abbiamo già dimostrato che gli LDL umani altamente purificati sono una fonte vitale di acidi grassi esogeni per la sintesi di PG, fornendo così un meccanismo per il bypass dell’inibitore di FASII³². Purificanti LDL umani può essere tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo, mentre le fonti commerciali di LDL umani purificati sono proibitivi da utilizzare su base di routine o per eseguire schermi batterici su larga scala. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo modificato una procedura per l’arricchimento dei LDL dal tuorlo d’uovo di gallina, una ricca fonte di particelle di lipoproteina³³. Abbiamo utilizzato con successo spettrometria di massa ad alta risoluzione, ad alta risoluzione/accurata e spettrometria di massa tandem per monitorare l’incorporazione di acidi grassi derivati da LDL umani nella membrana di S. aureus³². A differenza dei metodi precedentemente riportati, questo approccio può quantificare i singoli isomeri di acidi grassi per ciascuno dei tre principali tipi di fosfolipidi stafilocchidi. L’acido oleico (18:1) è un acido grasso insaturi presente all’interno di tutte le particelle di lipoproteina ospite che è prontamente incorporato nei fosfolipidi S. aureus ^29,30,32. S. aureus non è in grado di sintesi di acido oleico²⁹; pertanto, la quantità di acido oleico incorporato al fosfolipidi desta la presenza di acidi grassi di origine lipoproteina ospite all’interno della membrana stafilocca²⁹. Queste specie di fosfolipidi possono essere identificate con il metodo di spettrometria di massa all’avanguardia descritto qui, offrendo una risoluzione senza precedenti della composizione della membrana di S. aureus coltivata in presenza di una fonte di acido grasso che probabilmente durante l’infezione.