Culturing et mesure des os longs de murine fœtal et nouveau-né

La croissance de l’organe doit être étroitement accordée pour prévenir l’apparition de troubles de la croissance, et implique la régulation de plusieurs types de cellules, voies moléculaires et Diaphonie entre les différentes parties du corps. Les techniques d’imagerie sont essentielles pour remédier aux changements survenant au fil du temps dans un embryon en croissance, dans des conditions normales, ainsi qu’après une perturbation est induite dans le système. Les embryons avec développement intra-utérin, comme les modèles de rongeurs largement utilisés, présentent un défi supplémentaire pour l’imagerie en direct et le traitement médicamenteux, qui peut être partiellement surmonté en utilisant des techniques de culture ex vivo. Pour récapituler avec succès les processus in vivo et obtenir des résultats significatifs, il devient crucial de trouver les bonnes conditions culturantes pour chaque organe ou tissu.

La plupart des os du squelette mammalien poussent à travers l’ossification endochondrale, où le cartilage embryonnaire (composé de cellules appelées chondrocytes) entraîne une croissance longitudinale et est graduellement remplacé par l’OS. Ce processus se déroule aux plaques de croissance, situées à la fin des longs os, où trois zones peuvent être distinguées: repos, proliférative et hypertrophique^1,2. Tout d’abord, les chondrocytes ronds de progéniteur dans la zone de repos se transforme en chondrocytes en colonnes cycloaires dans la zone proliférative. Au cours de la prochaine étape de différenciation, ces chondrocytes deviennent hypertrophiques et commencent à sécréter le collagène de type X. Les chondrocytes hypertrophiques orchestrent les étapes suivantes de l’ossification: ils sécrètent des molécules de signalisation clés, telles que le facteur de croissance du tissu conjonctif, les protéines morphogénétiques des os et le hérisson indien, et dirigent la minéralisation de la matrice, recrutent les vaisseaux sanguins de la partie centrale de l’OS, et, sur l’apoptose, permettent aux ostéoblastes (cellules formant des os) d’envahir la matrice pour former le centre d’ossification primaire^3,4. La matrice minéralisée facilite la pénétration des vaisseaux sanguins à travers lesquels les ostéoblastes migrent pour remplacer ce cartilage dégradé par une matrice osseuse⁵. La plupart des ostéoblastes envahissent la matrice du cartilage du périchondrium, une couche fibreuse qui enveloppe le cartilage⁶. Alternativement, une proportion de chondrocytes hypertrophiques sont capables de survivre et de se transdifférencier en ostéoblastes^7,8,9. La longueur finale de l’OS est due à la croissance accumulée du cartilage transitoire, dont le taux de croissance dépend à son tour du nombre et de la taille des chondrocytes hypertrophiques, et de leur production matricielle¹⁰. En outre, il a été récemment montré que la durée de la dernière phase d’hypertrophie est corrélée avec la longueur finale de l’OS¹¹. Par conséquent, une régulation serrée de la prolifération et de la différenciation de ces cellules est nécessaire pour assurer une taille osseuse appropriée.

Malgré les connaissances substantielles acquises au fil des ans sur l’organisation et le développement des plaques de croissance, la plupart de ces conclusions reposent sur l’observation de sections histologiques fixes. Le sectionnement tissulaire fournit des informations précieuses sur ce processus, mais peut être monté avec des artefacts techniques, de sorte qu’il ne peut pas être toujours utilisé de manière fiable pour estimer les changements morphologiques ou de taille entre les différentes étapes. En outre, comme la croissance osseuse est un processus dynamique, les images statiques en deux dimensions (2D) offrent un aperçu limité du mouvement des cellules dans la plaque de croissance, tandis que l’imagerie Time-lapse sur les tissus vivants pourrait offrir des informations précieuses sur le comportement de la chondrocytes dans la plaque de croissance.

Toutes ces limitations peuvent être potentiellement résolues à l’aide de cultures osseuses ex vivo. Alors que les protocoles de culture osseuse ont été développés il y a quelque temps, ils ont été appliqués de près aux os longs murins. La plupart des études utilisent Chick Bones en raison des avantages techniques offerts par le poussin modèle^12,13. Des cultures organotypiques (interface air/liquide) ont été appliquées aux fémurs embryonnaires de poussins, qui ont été maintenus en culture pendant 10 jours¹⁴. Les outils génétiques sophistiqués disponibles dans la souris rendent ce modèle très attrayant pour être utilisé dans la culture osseuse ex vivo. Les études qui utilisaient des souris pour examiner la croissance osseuse travaillaient principalement avec des os métatarsiens¹⁵, probablement en raison de leur petite taille et de plus grands nombres obtenus par embryon¹⁶. Bien que traditionnellement considérés comme des os longs, les métatarsiens entrent dans la sénescence (caractérisée par une réduction de la prolifération et de l’involution de la plaque de croissance¹⁷) plus tôt que d’autres os longs in vivo, et par conséquent leur croissance continue ex vivo ne vraiment récapituler le processus in vivo. Aux fins du présent article, nous utiliserons le terme «os longs» pour les os des régions proximales et des membres intermédiaires. Plusieurs études antérieures utilisaient de longs os murins, comme le tibia, dans des cultures ex vivo et observaient une croissance substantielle du cartilage mais peu d’ossification¹⁸. Nous avons également utilisé les cultures tibiales récemment, principalement pour étudier la dynamique des chondrocytes¹⁹. D’autres études ont utilisé des têtes fémorales de jeunes souris²⁰ ou seulement la partie distale du fémur pour la culture²¹. Quelques travaux plus récents combinent avec succès la culture ex vivo des os complets avec l’imagerie Time-lapse pour acquérir des films tridimensionnels (3d) de chondrocytes dans le tissu de souris vivant^22,23. Les auteurs ont réussi à observer des événements précédemment inaperçus dans le réarrangement des chondrocytes à la zone proliférative²³ dans un bon exemple de l’application potentielle de la culture osseuse ex vivo. L’alternative, c’est-à-dire l’analyse d’images statiques, nécessite des techniques indirectes et complexes. Cela a été illustré par une étude récente évaluant l’importance des clones à orientation transversale pour la croissance du cartilage, où le traçage génétique avec des souches de souris de reporter multicolore couplé avec la modélisation mathématique ont été utilisés²⁴. Par conséquent, la culture ex vivo peut aider à mieux comprendre les processus dynamiques de manière plus rapide et plus directe.

Ici, nous présentons une méthode pour la culture des os longs murins, qui peut être combinée avec différents traitements moléculaires et/ou avec l’imagerie en direct Time-lapse. Ce protocole adapte les méthodes utilisées dans les rapports précédents^15,18,25, mais aborde quelques problèmes supplémentaires et se concentre sur les os longs tels que le tibia, plutôt que les os métatarsiens. Enfin, il explore le potentiel d’utiliser des comparaisons appariées statistiquement puissantes en cultivant les os gauche et droit séparément en présence de différentes substances.