Cultivo y medición de huesos largos del feto y del recién nacido murino

El crecimiento de órganos tiene que estar estrechamente afinado para prevenir la aparición de trastornos del crecimiento, e implica la regulación de múltiples tipos celulares, vías moleculares y diafonía entre diferentes partes del cuerpo. Las técnicas de imagen son esenciales para abordar los cambios que ocurren a lo largo del tiempo en un embrión en crecimiento, tanto en condiciones normales, como después de que se induce una perturbación en el sistema. Los embriones con desarrollo intrauterino, como los modelos de roedores ampliamente utilizados, presentan un desafío adicional para la imagen en vivo y el tratamiento farmacológico, que puede superarse parcialmente mediante el uso de técnicas de cultivo ex vivo. Para recapitular con éxito los procesos in vivo y obtener resultados significativos, resulta crucial encontrar las condiciones de cultivo correctas para cada órgano o tejido.

La mayoría de los huesos del esqueleto de mamíferos crecen a través de la osificación endocondral, donde el cartílago embrionario (compuesto de células denominadas condrocitos) impulsa el crecimiento longitudinal y se sustituye gradualmente por el hueso. Este proceso ocurre en las placas de crecimiento, situadas al final de los huesos largos, donde se pueden distinguir tres zonas: descansando, proliferativa e hipertrófica^1,2. Primero, los condrocitos de los progenitoras redondos en la transición de la zona de reposo en los condrocitos ciclistas columnar en la zona proliferativa. Durante la siguiente etapa de diferenciación, estos condrocitos se vuelven hipertróficos y empiezan a secretar colágeno tipo X. Los condrocitos hipertróficos orquestan los siguientes pasos de osificación: segretan moléculas clave de señalización, como el factor de crecimiento del tejido conjuntivo, proteínas morfolgenéticas óseas y erizo indio, y dirigen la mineralización de la matriz, reclutan los vasos sanguíneos a la parte central del hueso, y, sobre la apoptosis, permiten osteoblastos (células que forman hueso) para invadir la matriz para formar el centro de osificación primaria^3,4. La matriz mineralizada facilita la penetración de los vasos sanguíneos a través de los cuales los osteoblastos migran para reemplazar este cartílago degradado por una matriz ósea⁵. La mayoría de los osteoblastos invaden la matriz del cartílago del pericondrio, una capa fibrosa que envuelve el cartílago⁶. Alternativamente, una proporción de condrocitos hipertróficos son capaces de sobrevivir y transdiferenciar a osteoblastos^7,8,9. La longitud final del hueso se debe al crecimiento acumulado del cartílago transitorio, cuya tasa de crecimiento a su vez depende del número y tamaño de los condrocitos hipertróficos, y su producción matricial¹⁰. Además, se demostró recientemente que la duración de la última fase de la hipertrofia se correlaciona con la longitud final del hueso¹¹. Por lo tanto, se requiere una regulación estricta de la proliferación y diferenciación de estas células para asegurar el tamaño adecuado de los huesos.

A pesar de los sustanciales conocimientos adquiridos a lo largo de los años en la organización y desarrollo de las placas de crecimiento, la mayoría de estas conclusiones se basan en la observación de secciones histológicas fijas. La sección de tejido proporciona información valiosa sobre este proceso, pero se puede montar con artefactos técnicos, por lo que no se puede utilizar siempre de forma fiable para estimar los cambios morfológicos o de tamaño entre diferentes etapas. Además, a medida que el crecimiento óseo es un proceso dinámico, las imágenes estáticas bidimensionales (2D) ofrecen una visión limitada del movimiento de las células en la placa de crecimiento, mientras que la toma de imágenes de lapso de tiempo en el tejido vivo podría ofrecer información valiosa sobre el comportamiento de la condrocitos en la placa de crecimiento.

Todas estas limitaciones se pueden resolver potencialmente utilizando cultivos óseos ex vivo. Mientras que los protocolos de cultivo óseo se han desarrollado hace algún tiempo, se aplicaron limitadamente a los huesos largos murinos. La mayoría de los estudios utilizan huesos de polluelo debido a las ventajas técnicas ofrecidas por el Chick Model^12,13. Los cultivos organotíticos (interfaz aire/líquido) se aplicaron a las fémures embrionarias de polluelo, que se mantuvieron en cultivo durante 10 días¹⁴. Las sofisticadas herramientas genéticas disponibles en ratón hacen que este modelo sea muy atractivo para ser utilizado en cultivos de hueso ex vivo. Los estudios que utilizaron ratones para mirar el crecimiento óseo trabajaron principalmente con huesos metatarsos¹⁵, probablemente debido a su pequeño tamaño y mayor número obtenido por embrión¹⁶. Aunque tradicionalmente se consideran huesos largos, el metatarsi entra en la senescencia (caracterizado por una reducción de la proliferación y la involución de la placa de crecimiento¹⁷) antes que otros huesos largos in vivo, y por lo tanto su continuo crecimiento ex vivo no realmente recapitular el proceso in vivo. Para los fines de este artículo, utilizaremos el término huesos largos para los huesos de las regiones proximal e intermedia de las extremidades. Varios estudios previos utilizaron huesos murinos largos, como la tibia, en cultivos ex vivo y observaron un crecimiento sustancial del cartílago, pero poca osificación¹⁸. También usamos culturas tibial recientemente, principalmente para estudiar la dinámica de condrocitos¹⁹. Otros estudios utilizaron cabezas femorales de ratones jóvenes²⁰ o sólo la parte distal del fémur para la cultura²¹. Algunas obras más recientes combinan con éxito la cultura ex vivo de huesos llenos con imágenes de lapso de tiempo para adquirir películas tridimensionales (3D) de condrocitos en el tejido del ratón viviente^22,23. Los autores lograron observar eventos previamente inadvertidas en la reordenación de los condrocitos a la zona proliferativa²³ en un buen ejemplo de la posible aplicación de la cultura ósea ex vivo. La alternativa, es decir, el análisis de imágenes estáticas, requiere técnicas indirectas y complejas. Esto fue ejemplificado por un estudio reciente que valoró la importancia de los clones orientados transversalmente para el crecimiento del cartílago, donde se utilizaron el rastreo genético con cepas de ratones de reportero multicolor junto con el modelado matemático²⁴. Por lo tanto, la cultura ex vivo podría ayudar a profundizar en los procesos dinámicos de una manera más rápida y directa.

Aquí, presentamos un método para la cultura de los huesos largos murinos, que se puede combinar con diferentes tratamientos moleculares y/o con imágenes en vivo de lapso de tiempo. Este protocolo adapta los métodos utilizados en los informes anteriores^15,18,25, pero aborda algunos problemas adicionales y se centra en los huesos largos, como la tibia, en lugar de los huesos metatarsales. Por último, explora el potencial de usar comparaciones emparejadas estadísticamente poderosas mediante el cultivo de huesos izquierdos y derecho por separado en presencia de diferentes sustancias.