Kweken en meten van foetale en pasgeboren muizen lange botten

De orgaan groei moet strak worden afgestemd om de verschijning van groei wanorde te verhinderen, en impliceert de verordening van veelvoudige cel types, moleculaire wegen en overspraak onder verschillende delen van het lichaam. Imaging technieken zijn essentieel om de veranderingen die zich na verloop van tijd in een groeiend embryo, zowel in normale omstandigheden, als na een verstoring wordt geïnduceerd in het systeem aan te pakken. Embryo’s met intra-uteriene ontwikkeling, zoals de veelgebruikte knaagdieren modellen, presenteren een extra uitdaging voor Live Imaging en medicamenteuze behandeling, die gedeeltelijk kan worden overwonnen met behulp van ex vivo cultuurtechnieken. Om de in vivo processen succesvol te recapituleren en zinvolle resultaten te verkrijgen, wordt het cruciaal om de juiste kweken voorwaarden te vinden voor elk orgaan of weefsel.

De meeste botten van het zoogdier skelet groeien door endochondral ossificatie, waar het embryonale kraakbeen (bestaande uit cellen genaamd chondrocyten) drijft longitudinale groei en wordt geleidelijk vervangen door het bot. Dit proces gebeurt op de groei platen, gelegen aan het einde van de lange botten, waar drie zones kunnen worden onderscheiden: rusten, proliferatie, en hypertrofische^1,2. Ten eerste, de ronde voorloper chondrocyten in de rustzone overgang naar de wieler zuil chondrocyten in de proliferative zone. Tijdens het volgende stadium van differentiatie, worden deze chondrocyten hypertrofische en beginnen afscheidend type X collageen. Hypertrofische chondrocyten orkestreren de daaropvolgende stappen van ossificatie: ze scheiden belangrijke signalering moleculen, zoals bindweefsel groeifactor, bot morfogenetische eiwitten en Indiase egel, en direct de mineralisatie van de matrix, werven de bloedvaten aan het centrale deel van het been, en, op apoptosis, staan osteoblasten (been-vormende cellen) toe om de matrijs binnen te vallen om het primaire ossificatie centrum te vormen^3,4. De minerale matrix vergemakkelijkt de penetratie van de bloedvaten waardoor osteoblasten migreren naar dit gedegradeerde kraakbeen te vervangen door een bone matrix⁵. De meeste osteoblasten binnenvallen het kraakbeen matrix van de perichondrium, een vezelige laag die het kraakbeen wraps⁶. Als alternatief, een deel van hypertrofische chondrocyten zijn in staat om te overleven en te transdifferentiëren naar osteoblasten^7,8,9. De uiteindelijke lengte van het bot is te wijten aan de geaccumuleerde groei van de voorbijgaande kraakbeen, waarvan de groei op zijn beurt afhankelijk van het aantal en de grootte van de hypertrofische chondrocyten, en hun matrix productie¹⁰. Bovendien werd onlangs aangetoond dat de duur van de laatste hypertrofie fase correleert met de uiteindelijke lengte van het bot¹¹. Daarom, strakke regulering van de proliferatie en differentiatie van deze cellen is vereist om een goede been grootte te garanderen.

Ondanks de wezenlijke kennis die in de loop van de jaren op de organisatie en de ontwikkeling van de de groei platen wordt verworven, zijn het grootste deel van deze conclusies gebaseerd op de observatie van vaste histologische secties. De sectie van het weefsel verstrekt waardevolle informatie over dit proces, maar kan met technische artefacten worden gereden, zodat kan het niet altijd betrouwbaar worden gebruikt om morfologisch of grootte veranderingen tussen verschillende stadia te schatten. Bovendien, als bot groei is een dynamisch proces, de statische twee-dimensionale (2D) beelden bieden een beperkt inzicht in de beweging van de cellen in de groei plaat, terwijl time-lapse beeldvorming op levend weefsel kan waardevolle informatie over het gedrag van de te bieden chondrocyten in de groei plaat.

Al deze beperkingen kunnen mogelijk worden opgelost met behulp van ex vivo Bone cultures. Terwijl de bot-cultuur protocollen zijn enige tijd geleden ontwikkeld, werden ze beperkt toegepast op muizen lange botten. De meeste studies gebruiken kuiken beenderen toe te schrijven aan de technische voordelen die door het kuiken model worden aangeboden^12,13. Organotypic culturen (lucht/Liquid Interface) werden toegepast op kuiken embryonale femur, die werden gehandhaafd in de cultuur voor 10 dagen¹⁴. De geavanceerde genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in de muis maken dit model zeer aantrekkelijk om te worden gebruikt in ex vivo Bone cultuur. De studies die muizen gebruikt om te kijken naar de groei van het bot werkte meestal met metatarsale Bones¹⁵, waarschijnlijk te wijten aan hun kleine omvang en grotere aantallen verkregen per embryo¹⁶. Hoewel traditioneel beschouwd als lange botten, metatarsi Voer senescentie (gekenmerkt door een verminderde proliferatie en verwikkeling van de groei plaat¹⁷) eerder dan andere lange botten in vivo, en dus hun voortdurende groei ex vivo niet echt recapituleren het in vivo proces. Voor de toepassing van dit artikel, zullen we gebruik maken van de term lange botten voor botten uit de proximale en tussenliggende ledematen regio’s. Verscheidene vorige studies gebruikten lange muizen beenderen, zoals Tibia, in ex vivo culturen en waargenomen een wezenlijke groei van het kraakbeen maar weinig ossificatie¹⁸. We hebben ook gebruikt tibiaal culturen onlangs, vooral om te studeren chondrocyten Dynamics¹⁹. Andere studies gebruikt femorale hoofden van jonge muizen²⁰ of alleen het distale deel van het dijbeen voor cultuur²¹. Sommige recentere werken combineren met succes de ex vivo cultuur van volledige botten met time-lapse Imaging om driedimensionale (3D) films van chondrocyten te verwerven in het levende muis weefsel^22,23. De auteurs slaagden erin om eerder ongemerkte gebeurtenissen in de herschikking van chondrocyten aan de proliferative streek²³ in een goed voorbeeld van de potentiële toepassing van been ex vivo cultuur in acht te nemen. Het alternatief, dat wil zeggen, het analyseren van statische beelden, vereist indirecte en complexe technieken. Dit werd geïllustreerd door een recente studie het beoordelen van het belang van dwars-georiënteerde klonen voor kraakbeen groei, waar genetische tracering met multicolor reporter muis stammen in combinatie met wiskundige modellering werden gebruikt²⁴. Daarom kan de ex vivo cultuur helpen om inzicht te krijgen in dynamische processen op een snellere en meer eenvoudige manier.

Hier presenteren we een methode voor muizen lange botten cultuur, die kan worden gecombineerd met verschillende moleculaire behandelingen en/of met time-lapse Live Imaging. Dit protocol past de methoden die worden gebruikt in eerdere rapporten^15,18,25, maar adressen enkele extra problemen en richt zich op lange botten, zoals het scheenbeen, in plaats van metatarsale botten. Ten slotte onderzoekt het het potentieel van het gebruik van statistisch krachtige gepaarde vergelijkingen door kweken links en rechts botten afzonderlijk in de aanwezigheid van verschillende stoffen.