胎儿和新生儿小鼠长骨的培养与测量
概要
在这里, 我们提出了一种方法, 在胎儿和新生儿阶段的长小鼠骨骼的体外培养, 适用于分析骨骼和软骨的发展和稳态在受控条件下, 同时重述体内过程。
Abstract
长骨是复杂而动态的结构, 通过软骨中间体进行软骨内骨化。获得健康的人体骨骼的机会有限, 使得使用哺乳动物模型 (如小鼠和大鼠) 来研究骨骼生长和稳态的不同方面特别有价值。此外, 在小鼠身上开发复杂的遗传工具, 可以对长骨生长进行更复杂的研究, 并要求扩大用于研究骨骼生长的技术。在这里, 我们提出了一个详细的方案, 为体内小鼠骨培养, 允许研究骨和软骨在严格控制的方式, 同时重述大部分的体内过程。所描述的方法允许培养一系列的骨骼, 包括胫骨、股骨和掌骨, 但我们主要集中在胫骨培养。此外, 它还可与其他技术结合使用, 如延时实时成像或药物治疗。
Introduction
器官生长必须进行严格调整, 以防止生长障碍的出现, 并涉及调节多种细胞类型, 分子途径和身体不同部位之间的串扰。成像技术对于解决在正常条件下以及系统中引起扰动后在生长中的胚胎中随着时间的推移而发生的变化至关重要。宫内发育的胚胎, 如广泛使用的啮齿类动物模型, 对活体成像和药物治疗提出了额外的挑战, 可以通过使用体外培养技术来部分克服这些挑战。要成功地重述体内过程并获得有意义的结果, 为每个器官或组织找到正确的培养条件变得至关重要。
哺乳动物骨骼的大部分骨骼是通过软骨内骨化生长的, 胚胎软骨 (由称为软骨细胞的细胞组成) 推动纵向生长, 并逐渐被骨骼所取代。这个过程发生在生长板, 位于长骨的末端, 在那里可以区分三个区域: 休息, 增殖, 和肥厚1,2。首先, 休眠区的圆形祖细胞软骨细胞过渡到增殖区的循环柱状软骨细胞。在分化的下一个阶段, 这些软骨细胞变得肥厚, 并开始分泌 x 型胶原蛋白。肥厚软骨细胞组织骨化的后续步骤: 他们分泌关键的信号分子, 如结缔组织生长因子, 骨形态蛋白和印度刺猬, 并指导成矿基质, 招募血管到骨骼的中心部分, 并在凋亡时, 允许成骨细胞 (形成骨的细胞) 侵入基质, 形成原发骨化中心 3,4。矿化基质促进血管的渗透, 成骨细胞通过血管迁移, 用骨基质5取代这种退化的软骨。大多数成骨细胞从周长 (包裹软骨的纤维层) 侵入软骨基质.另外, 有一部分肥厚软骨细胞能够存活并转化为成骨细胞 7,8,9。骨骼的最终长度是由于短暂软骨的累积生长, 其生长速度反过来又取决于肥厚软骨细胞的数量和大小, 以及它们的基质产生10。此外, 最近还显示, 最后一个肥大阶段的持续时间与骨骼1 1的最后长度有关。因此, 需要严格调节这些细胞的增殖和分化, 以确保适当的骨骼大小。
尽管多年来获得了大量知识, 关于生长板的组织和发展, 但这些结论大多是基于对固定组织学部分的观察。组织切片提供了有关这一过程的有价值的信息, 但可以利用技术伪影, 因此它不能总是可靠地用于估计不同阶段之间的形态或大小变化。此外, 由于骨骼生长是一个动态过程, 静态二维 (2D) 图像提供了对生长板细胞运动的有限洞察, 而活体组织上的延时成像可以提供有关细胞行为的有价值的信息。生长板中的软骨细胞。
所有这些限制都可以通过使用体外骨培养来解决。虽然骨培养协议是在一段时间前已经开发出来, 他们被有限地应用于小鼠长骨。由于小鸡模型12、13 提供的技术优势, 大多数研究都使用了小鸡骨。将组织型培养物 (空气-液体界面) 应用于雏鸡胚胎股骨, 在培养中维持 10天14天。小鼠可用的复杂遗传工具使这一模型在体外骨培养中非常有吸引力。利用小鼠研究骨骼生长的研究主要与骨骨 15有关, 这可能是由于它们体积小, 每个胚胎16岁获得的数量更多。虽然传统上被认为是长骨, 但元骨在体内比其他长骨更早进入衰老 (其特点是生长板的增殖和卷曲减少), 因此它们在体内的连续生长不会提前真正重述体内的过程。为了本文的目的, 我们将使用长期骨骼一词的骨骼从近端和中间肢体区域。此前的几项研究在体外培养中使用了胫骨等长小鼠骨骼, 观察到软骨的大量生长, 但很少骨化18。我们最近还使用胫骨培养法, 主要研究软骨细胞动力学19。其他研究使用年轻小鼠20 的股骨头或仅股骨的远端部分培养21。最近的一些作品成功地将全骨的体外培养与延时成像结合起来, 获得活着的老鼠组织中软骨细胞的三维 (3d)电影 22,23。作者成功地观察了以前未被注意到的软骨细胞重新排列到增殖区23的事件, 这是骨体外培养潜在应用的一个很好的例子。另一种方法, 即分析静态图像, 需要间接和复杂的技术。最近的一项研究评估了横向克隆对软骨生长的重要性, 使用了多色记者小鼠菌株的遗传追踪和数学建模 24.因此, 体外培养可能有助于以更快、更直接的方式深入了解动态过程。
在这里, 我们提出了一种方法, 小鼠长骨培养, 它可以结合不同的分子治疗和/延时活体成像。该协议调整了前一次报告 15、18、25中使用的方法, 但解决了一些其他问题, 并侧重于长骨, 如胫骨, 而不是掌骨。最后, 它探讨了使用统计强大的配对比较的潜力, 通过培养左和右骨分别存在不同的物质。
Protocol
Representative Results
Discussion
骨外培养方法已经使用了一段时间来评估骨生长的生物学 28, 但很少应用于小鼠长骨。随着成像技术的发展, 体外骨培养为在与体内条件非常相似的环境中实时研究骨骼生长提供了一种有吸引力的方法。在这种情况下, 重要的是要定义长骨生长与其在体内生长相当的条件。
在本研究中, 我们描述了一个简单且经济实惠的长骨培养协议, 解决了其局限性和可能的?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢亚历山大·乔伊纳在这一协议制定时给予的支持, 感谢艾德温娜·麦格林恩和张一成分享维甲酸。澳大利亚再生医学研究所得到维多利亚州政府和澳大利亚政府的赠款。
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2-mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
参考文献
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