非還元 SDS − PAGE 分析と化学的架橋を組み合わせて、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する

ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。最近の仕事では、この結合はまた、可逆的な翻訳後修飾として分類されており、タンパク質機能、位置および相互作用^1、2の変調を可能にするシステインベースの「レドックススイッチ」として機能し、 ^3、4。したがって、この変更を研究することができることが重要です。これらのシステイン安定化多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元性 SDS − PAGE 分析⁵を介して行う。SDS − PAGE 分析は、多くの実験室で用いられる技術であり、その結果は、迅速かつ容易に、かつ最小限のコストで解釈することができ、質量分析などのジスルフィド結合を同定するために使用される他の技術よりも有利である。 ^、7及び円形二色性⁸.

この方法が研究に役立つ適切な技術であるかどうかを決定するための1つの重要なステップは、関心のあるタンパク質の一次配列を徹底的に調べて、システイン残基 (複数可) が存在することを保証することである。もう一つの有用なステップは、公開またはバイオインフォマティクスアプリケーションを使用して、システイン残基 (複数可) が位置することができる場所を視覚化するために、目的のタンパク質の三次元構造を探索するために、以前の結晶構造を研究することです。残渣 (複数可) が外面上に存在する場合は、構造体の内側に埋設されたシステイン残基ではなくジスルフィド結合を形成する方が良い候補であり得る。しかしながら、タンパク質は、基質相互作用またはタンパク質-蛋白質相互作用によって、これらの残留物が環境にも暴露されるようになると構造的な変化を起こす可能性があることに注意することが重要です。

同定された多量体複合体は、ホルムアルデヒドを使用して化学架橋で検証することができます。ホルムアルデヒドは、2-3 Åの高い細胞透過性および短い架橋スパンによるこの検証技術のための理想的なクロスリンカーであり、特定のタンパク質-蛋白質相互作用の検出を確実にする^9,10。ここで、この方法は、ヒト骨骨肉腫細胞株 dUTPase OS¹¹からの原発性の核アイソフォームを解析することにより図示される。しかし、このプロトコルは、他の細胞株、組織および生物に適合させることができる。