As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Um método simples para analisar complexos multimérica estabilizados por estas ligações é através da análise de SDS-PAGE não-reduzindo. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS.
As estruturas de muitas proteínas são estabilizadas através de ligações de dissulfeto covalente. Em trabalhos recentes, esse vínculo também foi classificado como uma modificação pós-translacional. Assim, é importante ser capaz de estudar esta modificação em células vivas. Um método simples para analisar estes complexos multimérica cisteína-estabilizados é através de um método de duas etapas de não-reduzindo a análise SDS-PAGE e o cross-linking do formaldehyde. Este método de duas etapas é vantajoso como o primeiro passo para desvendar complexos multiméricos estabilizados por ligações dissulfeto devido à sua facilidade técnica e baixo custo de operação. Aqui, a linha celular do osteosarcoma do osso humano U-2 ósmio é usada para ilustrar este método analisando especificamente o isoforma nuclear de dUTPase.
As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Em trabalhos recentes, esse vínculo também foi classificado como uma modificação pós-translacional reversível, atuando como um “interruptor redox” baseado em cisteína, permitindo a modulação da função protéica, localização e interação1,2, 3,4. Assim, é importante ser capaz de estudar esta modificação. Um método simples para analisar esses complexos multiméricos estabilizados com cisteína é através da análise de SDS-PAGE não redutora5. A análise de SDS-PAGE é uma técnica usada em muitos laboratórios, onde os resultados podem ser obtidos e interpretados rapidamente, fàcilmente, e com custos mínimos, e são vantajosos sobre outras técnicas usadas para identificar ligações do dissulfide tais como a espectrometria maciça6 ,7 e Dicroísmo circular8.
Uma etapa importante em determinar se este método é uma técnica apropriada a ajudar em um estudo é examinar completamente a seqüência preliminar da proteína do interesse para segurar lá é resíduo do cisteína (s) atual. Outro passo útil é Pesquisar quaisquer estruturas de cristais anteriores publicadas ou usar uma aplicação de Bioinformática para explorar a estrutura tridimensional da proteína de interesse para visualizar onde os resíduos de cisteína podem ser localizados. Se o resíduo (s) está presente na superfície exterior pode ser um candidato melhor para formar uma ligação dissulfeto em vez de um resíduo de cisteína enterrado no interior da estrutura. No entanto, é importante notar que as proteínas podem sofrer alterações estruturais em interações de substrato ou interações proteína-proteína, permitindo que esses resíduos, em seguida, tornar-se exposto ao ambiente também.
Os complexos multimérica identificados podem então ser verificados com cross-linking químico usando o formaldehyde. O formaldehyde é um cross-linker ideal para esta técnica da verificação devido à permeabilidade elevada da pilha e à extensão cross-linking curta de ~ 2-3 Å, assegurando a deteção de interações específicas da proteína-proteína9,10. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS11. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para outras linhas celulares, tecidos e organismos.
O método esboçado aqui dá um protocolo reto-forward para a análise de complexos multimérica estabilizados através dos LINKAGES do dissulfide. Este protocolo pode facilmente ser adaptado a outras linhas da cultura de pilha, tecidos e organismos permitindo uma escala de aplicações larga.
Um passo importante neste procedimento é garantir que as ligações dissulfeto não são uma consequência do procedimento de extração. Qualquer resíduo de cisteína livre pode ser bloqueado usando i…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos imensamente os esforços desenvolvidos pelo Dr. Jennifer Fischer para a purificação do anticorpo policlonal dUTPase e Kerri Ciccaglione para todos os seus esforços para ajudar a editar este manuscrito. Esta pesquisa foi parcialmente apoiada por uma subvenção da Fundação de saúde de Nova Jersey (Grant #PC 11-18).
16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
18CO | ATCC | CRL-1459 | |
6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
A549 | ATCC | CCL-185 | |
Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
Bromophenol Blue | |||
BSA | Cell signaling | 99985 | |
Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
DMEM | Gibco | 11330-032 | |
Drill | |||
EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
Glass-teflon homogenizer | |||
Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
Glycine | RPI | 636050 | |
Heat block | Denville | 10285-D | |
Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
Methanol | Pharmco | 339000000 | |
Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
Posi-click tube | Denville | C2170 | |
Power supply | Biorad | 200120 | |
Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
SDS | Biorad | 161-0302 | |
Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
Sodium chloride | RPI | S23020 | |
Sodium pyruvate | Gibco | ||
Sonicator | Branson | 450 | |
Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
Stir plate | Corning | PC353 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
Tris Base | RPI | T60040 | |
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
X-ray film | ThermoFisher | 34090 |