이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 이러한 고리에 의해 안정화 된 다중 이성질체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해 서 이다. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS 로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다.
많은 단백질의 구조는 공유 이황화 결합을 통해 안정화 됩니다. 최근 작업에서,이 결합은 또한 번역 후 변형으로 분류 되었다. 따라서, 살아있는 세포에서 이러한 변형을 연구할 수 있는 것이 중요 하다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 포름알데히드 가교의 2 단계 방법을 통해 서 이다. 이러한 2 단계 방법은 그 기술적 용이성 및 낮은 운용 비용으로 인해 이황화 물 결합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 발굴 하는 첫 번째 단계로 서 유리 하다. 여기서, 인간 뼈 골 육 종 세포 주는 U-2 OS는 dUTPase의 핵이 소 형태를 구체적으로 분석 함으로써이 방법을 설명 하기 위해 사용 된다.
이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 최근 작업에서, 이러한 결합은 가역 적 번역 후 변형으로 분류 되었으며, 시스테인 기반 “산화 환 원 스위치”로 작용 하 여 단백질 기능, 위치 및 상호작용의 변조를 허용 하는1,2, 3,4. 따라서,이 수정을 연구 할 수 있는 것이 중요 합니다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해5. SDS-PAGE 분석은 많은 실험실에서 사용 되는 기술로, 결과를 신속 하 고 쉽게 분석 하 고 최소한의 비용으로 해석 할 수 있으며 질량 분석기와 같은 이황화 물 결합을 식별 하는 데 사용 되는 다른 기술 보다 유리 합니다6 ,7 및 원형 중 크롬 산8.
이 방법이 연구에 도움을 주는 적절 한 기술 인지 결정 하는 한 가지 중요 한 단계는 시스테인 잔기 (들)이 존재 하는 것을 보장 하기 위해 관심 있는 단백질의 일차 서 열을 철저히 조사 하는 것 이다. 또 다른 유용한 단계는 게시 된 임의의 이전 결정 구조를 연구 하거나 생물 정보학 응용 프로그램을 사용 하 여 관심 있는 단백질의 3 차원 구조를 탐구 하 여 시스테인 잔기 (들)가 위치할 수 있는 곳을 가시화 하는 것 이다. 잔류물 (들)이 외부 표면 상에 존재 하는 경우에는 상기 구조의 내부에 묻혀 있는 시스테인 잔기가 아닌 이황화 결합을 형성 하는 것이 더 좋은 후보가 될 수 있다. 그러나 단백질이 기질 상호 작용 또는 단백질-단백질 상호작용에 따라 구조적 변화를 겪을 수 있으므로 이러한 잔류 물이 환경에 노출 될 수도 있다는 점에 유의 해야 합니다.
확인 된 다이 성체 복합체는 포름알데히드를 사용 하 여 화학적 가교 결합으로 확인 될 수 있다. 포름알데히드는 높은 세포 투과성 및 짧은 가교 범위에 기인한이 검증 기술에 대 한 이상적인 교차 링커입니다 ~ 2-3 Å, 특정 단백질-단백질 상호작용의 검출을 보장 하는9,10. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS11로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다. 그러나,이 프로토콜은 그밖 세포 선, 조직 및 유기 체를 위해 적응 될 수 있습니다.
여기에 설명 된 방법은 이황화 물 결합을 통해 안정화 된 다이 성체 복합체의 분석을 위한 바로 앞 프로토콜을 제공 한다. 이 프로토콜은 다른 세포 배양 라인, 조직 및 유기 체에 쉽게 적용 될 수 있어 광범위 한 응용 분야에 적합 합니다.
이 절차의 중요 한 단계는 이황화 물 연결이 추출 절차의 결과를 보장 하는 것입니다. 임의의 자유 시스테인 잔기는 iodoacetamide<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
이 원고를 편집 하는 데 도움이 되는 모든 노력을 dUTPase 다 클론 항 체와 Kerri Ciccaglione의 정화를 위해 제니퍼 피셔 박사에 게 전 하는 노력에 감사 드립니다. 이 연구는 뉴저지 보건 재단의 보조금으로 부분적으로 지원 되었습니다 (보조금 #PC 11-18).
16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
18CO | ATCC | CRL-1459 | |
6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
A549 | ATCC | CCL-185 | |
Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
Bromophenol Blue | |||
BSA | Cell signaling | 99985 | |
Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
DMEM | Gibco | 11330-032 | |
Drill | |||
EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
Glass-teflon homogenizer | |||
Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
Glycine | RPI | 636050 | |
Heat block | Denville | 10285-D | |
Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
Methanol | Pharmco | 339000000 | |
Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
Posi-click tube | Denville | C2170 | |
Power supply | Biorad | 200120 | |
Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
SDS | Biorad | 161-0302 | |
Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
Sodium chloride | RPI | S23020 | |
Sodium pyruvate | Gibco | ||
Sonicator | Branson | 450 | |
Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
Stir plate | Corning | PC353 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
Tris Base | RPI | T60040 | |
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
X-ray film | ThermoFisher | 34090 |