サルモネラおよび他の病原体に対する上皮細胞保護を研究・修飾するためのヒト誘導多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの使用

1. 多能性幹細胞の培養と継代 注:ここに記載されたすべての方法は、市販のヒト細胞株を使用する。以下に詳述されるすべての組織培養作業は、クラス II 層流フードで行う必要があります。iPSCs は、iPSCs の週末のない文化を可能にするメーカーの指示に従って、幹細胞培養培地で日常的に維持されています (材料の表を参照してください)。iPSCs は、他の iPSC 培養システムから比較的容易に適合させることができます。 いったんコロニーがプレート表面の約 80% – 90% を覆うと、細胞を通過させる。 ダルベッコ改変のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS、カルシウム [Ca] またはマグネシウム [Mg]) に希釈したビトロネクチン10μ g/mL を組織培養処理プレートに添加することで、使用前の継代用プレートを調製します。コーティングのためのボリュームは、プレートのサイズに依存しており、メーカーの指示で見つけることができます。この間、室温 (RT) への温かい幹細胞培養培地。 パッセージの準備ができている iPSCs からメディアを取り出し、DPBS (Ca または Mg なし) でセルを2倍洗ってください。 EDTA 溶液 (材料の表を参照) をプレートに追加し、表面全体をコーティングし、RT で 5 ~ 8 分間インキュベートします。IPSC コロニーの中心に孔が現れ始めると、EDTA 溶液を吸引除去する。 ウェルに幹細胞培養培地を追加します。皿の表面を数回軽く洗うことによって、iPSCs を取り除きます。IPSCs は、単一のセルとしてではなく、束として継代されるので、EDTA 溶液が長時間放置されていないことを確認してください。任意の外れた iPSCs を 15 mL の円錐形のチューブに移動します。 ラミニンフラグメントプレートからビトロネクチンを吸引し、幹細胞培養培地と交換します。IPSC 懸濁液を何度も反転させて iPSCs が円錐管の底部に収まっていないことを確認し、適切な懸濁液量を加えて、新しいプレート上の1:10 希釈の細胞を得た。分割比率は、iPSC の成長速度に応じて調整することができ、iPSC ライン間で異なる場合があります。 プレートをロックして iPSCs を表面に分散させ、37° c/5% CO2 のインキュベーター内に置きます。継代の翌日に iPSCs を養う。 2. iPSCs から Hindgut への分化 0 日目に、10 cm 組織培養処理皿に iPSCs を分割し、ステップ1.2 で説明したようにビトロネクチンと共に、アクチビン a (10 Ng/ml) + 塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF; 12 Ng/ml) を添加した 10 mL の幹培養培地にラミニンフラグメント。使用する前に、成長因子を直接メディアに追加してください。これは、以降のすべての手順で行います。 1 日目に、培地 (アクチビン a [10 Ng/ml] + bFGF [12 Ng/ml]) を持つ幹細胞培養液 10 mL を変更します。 2 日目に、次の成長因子を補足した幹細胞培養培地 10 mL にメディアを変更することによって分化を開始する: アクチビン A (100 Ng/ml)、bFGF (100 ng/ml)、骨形態形成タンパク質 4 (BMP-4; 10 Ng/ml)、ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ阻害剤は LY294002 (10 μ m)、および GSK3 阻害剤 CHIR99021 (3 μ m) を有する。 3 日目に、10 mL の幹細胞培養培地にアクチビン A (100 Ng/ml) を添加し、bFGF (100 ng/ml)、BMP-4 (10 ng/ml)、および LY294002 (10 μ m) を補充してメディアを変更する。この培地によって誘導された内胚葉仕様は、次の24時間にわたって iPSC コロニー形態に目に見える変化をもたらすはずである。 4 日目に、10 mL の培地にアクチビン a (100 Ng/ml) および bFGF (100 Ng/ml) を添加した RPMI/B27 培地を交換する。注:RPMI/B27 培地には、L-グルタミンサプリメント (表 1参照)、10 ML の B27 サプリメント (50x、血清フリー)、および非必須アミノ酸 5 ml の 500 mL が含まれています。任意: 5 mL のペニシリン-ストレプトマイシン (1万 U/mL) を加えなさい。フィルター-使用前に滅菌します。 5 日目に、培地を 10 ML の RPMI/B-27 培地にアクチビン a (50 Ng/mL) を添加して交換した。 6 日目に、hindgut に事後内胚葉のパターニングを開始し、CHIR99021 (6 μ m) + レチノイン酸 (3 μ m) を添加して 10 ML の RPMI/B27 培地に培地を変更する。 7、 8、 9日目に、ステップ2.7 を繰り返します。これらのステップの間、hindgut の目に見える3-d 構造は、プレートの表面を覆う、明らかになるはずです。 10 日目に、得られた hindgut を基底膜マトリクスに埋め込む (材料の表を参照)。 3. 基底膜マトリクスに Hindgut の埋め込み IHO のベース成長培地を作ります 500 (ダルベッコ改変の高度な改良型イーグルの中 [DMEM]/F12、10 ml の B27 サプリメント [50x、血清遊離]、5 ml の N2 サプリメント [100x、血清遊離]、5ml の 1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、および5Ml の非必須アミノ酸 [100x]オプション: 5 mL のペニシリン-ストレプトマイシン [1万 U/mL] を加えてください。フィルター-使用前に滅菌します。表 1参照)。 Hindgut プレートからメディアを取り出し、プレート1x を DPBS で洗浄します (Ca または Mg なし)。プレートにコラゲナーゼ溶液 5 mL を加え、37° c で5分間インキュベートします。 500 mg のコラゲナーゼ IV 粉末を 400 mL の高度な DMEM/F12 に添加することによってコラゲナーゼ溶液を生成する。これに続いて、100 mL の血清置換物 (材料の表を参照) を加え、L-グルタミンの 5 ml (200 mM)、および 2-メルカプトエタノールの3.5 μ l を添加し、混合するための溶液を旋回させる。フィルター-コラゲナーゼ粉末が完全に溶解したら、溶液を滅菌します。注:これはより小さいアリコートで-20 ° c に6か月まで貯えることができる。 IHO ベース成長培地をプレートに 5 mL 添加し、セルスクレーパーを使用して hindgut 細胞を掻き取り、15 mL の円錐形のチューブに hindgut 懸濁液を収集することによって、コラゲナーゼを不活性化する。 1分間 240 x gで遠心分離し、上澄み液を剥がします。 10 mL のメディアを追加し、hindgut を軽くピペッティングして小さい部分に分割し、95 x gで1分間遠心分離します。 ステップ3.5 を繰り返すことにより、iHO ベース成長培地中の細胞2x を洗浄する。再懸濁は、塩基成長培地 (~ 300 ~ 500 μ l) の小容量の細胞を増殖させるとともに、この溶液の約100μ l を地下膜マトリックスの 1.5 mL に加える。マトリックスは RT で急速に固化し始めるので、この間は氷の上に残しておく必要があります。 プレートヒーターの24ウェルプレートを37° c でセットアップし、60μ l を24ウェルプレートの1ウェルにスポットアウトします。それが簡単に設定し、顕微鏡下で密度を確認することができます。 必要な場合は、所望の濃度が達成されるまで段階的に基底膜マトリクスに hindgut 溶液を追加し、残りの井戸に溶液をスポットアウトします。 37° c で10分間インキュベートします。次いで、24ウェルプレートの各ウェルに成長因子を含有する800μ l の iHO を以下の濃度で添加する (表 1参照): 500 Ng/ml R-spondin-1, 100 Ng/ml ノギン, 100 Ng/ml 上皮成長因子 (EGF), 3 μ m CHIR99021, 2.5 μ mプロスタグランジン E2, 10 μ m Y-27632 dihydrochloride 一水和物 (ロック阻害剤). IHO ベースの成長メディアを 2 ~ 3 日ごと、またはメディアが変色し始めるとすぐに変更します。基底膜マトリックスに最初に播種した後、iHOs は、それらを分割する前に7日間開発することができます。3 ~ 4 日目には、異なる球体がカルチャに表示されます。 メディア変更のみの場合は、分割/シード時にのみ必要となるため、Y-27632 を省略してください。 4. iHOs のメンテナンスと通過 漸進的な解凍を可能にするために、分離する前に、4° c で覆われた氷のバケツの基底膜マトリックスの必要な容積を一晩、24時間に出してください。 IHOs からメディアを取り出し、ウェルごとに500μ l のセルリフティング溶液 (材料の表を参照) と交換します。4° c で 40 ~ 50 分間インキュベートし、その時点で iHOs は溶液の中で浮いている必要があります。 オプション: インフードイメージングシステムを使用して、目的の形態の iHOs のみを選択します (「材料の表」を参照)。 IHOs を壊さないように、iHO/細胞リフティング溶液懸濁液を 15 mL の円錐形のチューブにやさしくピペットで入れます。IHOs が3〜5分間沈降し、上清および単一細胞を除去することを許可する。 再懸濁は、iHO 塩基成長培地の5ml 中に iHOs を入れ、それらを優しく洗浄するためにピペットで入れます。95 x gで2分間遠心します。 フード内で37° c のプレートヒーターに24ウェルプレートを設置します。 上清を除去し、P1000 ピペットを使用して、iHOs ~ 300 ~ 500 μ l のベース成長培地に再懸濁を加え、iHOs をより小さなチャンクに分割します。適用する必要がある力は iHO ラインおよび成熟状態によって変わるので、穏やかに開始し、必要であれば力を増加させることに注意してください。 IHOs の〜100μ l の場所 (容積は溶液の密度に依存している) を基底膜マトリックスの 1.5 mL に、簡単に混合するためにピペットで入れる。 基底膜マトリクスの 1 x 60 μ l を24ウェルプレートの1つのウェルにスポットアウトし、それを ~ 30 s の間固化させるようにしてから、顕微鏡下で密度を確認する。密度が低すぎる場合は、マトリックスにさらに iHOs を追加します。 正しい密度が取得されるまでステップ4.8 を繰り返し、残りの行列を24ウェルプレートにスポットします。 ステップ3.7 に記載されているように、37° c のインキュベーター内に10分間置き、次いで、成長因子を有する塩基成長培地の800μ l でそれをオーバレイする。 侵襲アッセイ実験 (以下に概説) のための iHOs を準備するために、ステップ4.1 〜4.10 に記載されている実験の前に iHOs を4〜5日通過するが、ステップ4.7 で生成したマトリックス iHO 溶液を 5 mm ガラス底マイクロインジェクション皿に120配置する。 ルーチンの継代のように、液滴に iHO 懸濁液を残すのではなく、皿の底に液滴を広げて、マトリックスの薄層を作成します。ベース成長培地 + 成長因子の 2.5 mL でそれをカバーしています。注:抗生物質が培地中で使用されている場合は、これらを除去し、マイクロインジェクション実験のために nonantibiotic 添加媒体で置換しなければならない。 5. rhIL との iHOs の Prestimulation IHOs からメディアを吸引し、新たなベース成長培地 (抗生物質を含んではならない) に 18 h を侵襲アッセイに置き換える。 100 ng/mL の最終濃度に培養培地に rhIL-22 を加えます。 6. iHOs および細胞内浸潤アッセイの微量注入 実験の前日にSを設定します。サルモネラは Luria-Bertani ブロスの 10 mL で SL1344 培養し、振盪しながら一晩37° c でインキュベートする。 実験当日、密閉された熱室を有する顕微鏡が利用可能である場合、それをオンにして、アッセイを開始する前に温度が37° c に達するのを許容する。 DPBS (Ca および Mg を含有する) における一晩の細菌培養物を 600 nm (OD600) で2の光学密度に希釈し、次いで、それをフェノールレッドと混合して1:1 する。 顕微鏡ステージ上に iHOs を含むマイクロインジェクションディッシュをロードし、蓋を取り外し、iHOs を焦点にして、射出を開始する準備が整います。 インジェクタとアーム制御ステーションをオンにします。インジェクタが、600 kPa の圧力および 0.5 s の射出時間に設定されていることを確認します。顕微鏡段階からまだバックアップされていない場合は、射出アームを回転させて、それがあることを確認します。 針から包むことおよびプラスチックシリンダーを取除くことによって6μ m のマイクロインジェクションのドリル先端をセットアップしなさい。射出アームからグリップヘッドを取り外します。 ドリル先端に10μ l の接種を行い、その鈍い末端で優しくドリル先端を把持する。ドリル先端をグリップヘッドに挿入し、マイクロインジェクションアームに取り付け直します。 針がマイクロインジェクションディッシュの 1 ~ 2cm 上にあるように、腕をゆっくりと位置に移動します。腕のコントロールを使用して、針の先端を皿の中央に置き、メディアの表面のちょうど上になるまで下ろします。 すべての注射の後、このポイントに針を返すために、arm 制御ステーションをプログラムします。 顕微鏡を iHOs に当て、注入するターゲットを選択します。注射されるように、iHO のすぐ上と右に針を配置し、iHO ルーメンの下と横方向に針を移動します。 Microinjector に注入ボタンを押してください。フェノール染色された細菌混合物が針から出てきます。各 iHO 3x を注入してください。条件ごとに少なくとも 30 iHOs を注入します。注:培養内の iHO サイズおよび構造における不均一性のために、変動を制御するために多数の iHOs を注入することが必要である。 すべての必要な iHOs が注入されたら、ステージからマイクロインジェクションプレートを取り出し、蓋を交換して、プレートを90分間37° c でインキュベートします。 90分後、成長培地を吸引し、3 mL の細胞リフティング溶液に交換します。4° c で45分間インキュベートします。 IHOs/セルリフティングソリューションを 5 mL の DPBS を含む 15 mL の円錐チューブにそっと移動させる。注入した iHOs がすべてプレートから取り外されていることを確認します (必要に応じてプレートを1Ml の DPBS ですすいでください)。370 x gで3分間遠心します。 上清を除去し、0.1 mg/mL でゲンタマイシンを含む塩基成長培地で iHOs を再懸濁 (1 mL の培地を加え、P1000 ピペット〜50x を使用して iHOs を分解し、さらに 4 mL の培地を加える)。 37° c で1時間インキュベートして細胞外細菌を死滅させる。 IHOs を 370 x gで3分間遠心し、上清を吸引し、できるだけ少なく残します。再び DPBS と遠心分離機で iHOs 1x を洗ってください。注:このステップは、細胞が溶解すると、残りのゲンタマイシンが細胞内細菌を死滅させることが重要であるゲンタマイシンを除去する。 再懸濁は、iHOs を溶解バッファーの500μ l で (材料の表を参照)、ピペッティング〜50x によってオルガノイドを手動で解離させる。この混合物を RT で5分間放置します。 DPBS で得られた溶液10倍を連続的に希釈し、10-1, 10-2, および 10-3濃度を生成する。ピペット prewarmed の LB の寒天の版に端正な、希釈された解決の 3 x 20 μ l の液滴。 37° c で一晩インキュベートし、コロニー計数およびコロニー形成単位 (CFU) の計算を行います。コロニー数は、細胞溶解するプロセス中に放出された細胞内細菌の数を反映する。 7. 細胞の凍結と回復 注:既に説明したように、必要に応じて iHOs を保存して再構成凍結ことができます。凍結と解凍のプロセスは、以下に概説されています. 凍結したい iHOs の井戸を選択します。ウェルにセルリフティングソリューションを追加し、4° c で40〜50分インキュベートします。IHOs は、ソリューションにフローティングする必要があります。 IHOs をゆっくりと 15 mL の円錐形のチューブにピペットで入れ、沈降させます。メディアを取り外し、ベース成長メディア (成長因子なし) で iHOs 1x を洗ってください。 95 x gで2分間遠心分離し、上澄みを取り除き、適切な量の細胞凍結培地に交換します (材料の表を参照してください、製造業者の指示に従って媒体を使用してください)、iHOs を超低温バイアルにデカントします。 より緩やかな凍結を可能にするために-80 ° c の冷凍庫にバイアルを保管してください。その後、液体窒素貯蔵庫に移します。 IHOs を再構築するには、水/ビーズ浴を使用して37° c で極低温バイアルを急速に解凍します。その後、その内容物を 10 mL のベース成長培地 (成長因子なし) にやさしくピペットで入れます。IHOs が新しいベース成長メディアの ~ 300 μ l のメディアを決済して交換できるようにします。 IHOs を手動で切り離すことはできません。基底膜マトリックスに iHOs を追加し、セクション3で説明されているようにそれらをプレートします。