인간 유도 만능 줄기 세포 유래 장 소기관을 사용 하 여 살 모 넬 라 및 기타 병원 균에 대 한 상피 세포 보호 연구 및 수정

1. 유도 만능 줄기 세포의 배양 및 패스 에이징 참고: 여기에 설명 된 모든 방법은 상업적으로 이용 가능한 인간 세포 주를 사용 한다. 아래에 자세히 설명 된 모든 조직 배양 작업은 클래스 II 층 류 후드에서 수행 해야 합니다. iPSCs는 정기적으로 줄기 세포 배양 배지 ( 재료 표참조)에서 유지 되며, 제조업체의 지침에 따라 주말에는 ipscs 문화를 허용 합니다. iPSCs는 상대적으로 쉽게 다른 Ipscs 문화 시스템에서 적응 될 수 있습니다. 콜로 니가 한 번 세포를 통과 하면 플레이트 표면의 약 80% ~ 90%가 커버 됩니다. 사용 하기 전에 통로 1 h에 대 한 플레이트를 준비 하 여, Dulbecco의 인산 완충 식 염 수 (DPBS)에 희석 한 vitronectin를 추가 하 여 조직 배양 처리 접시에 첨가 한다. 코팅에 대 한 볼륨은 플레이트 크기에 따라 다르며 제조업체의 지침에서 찾을 수 있습니다. 이 시간 동안, 줄기 세포 배양 액을 실 온 (RT)로 따뜻하게 한다. 통로를 위해 준비 된 iPSCs에서 매체를 제거 하 고 DPBS (Ca 또는 Mg 없이)로 2 배 세포를 씻으십시오. 플레이트에 EDTA 용액 ( 재료 표참조)을 추가 하 여 표면 전체를 5 ~ 8 분 동안 RT에서 코팅 하 고 배양 하십시오. 구멍이 iPSC 콜로 니의 중심에 나타나기 시작 하면, EDTA 용액을 흡 인 및 폐기 한다. 웰에 줄기 세포 배양 액을 추가 하는 단계; 플레이트 표면을 몇 번 부드럽게 세척 하 여 iPSCs를 분리 합니다. IPSCs는 단일 세포가 아닌 덩어리로 서 통행 하므로 EDTA 용액이 너무 오래 방치 되지 않았는지 확인 하십시오. 모든 분리 된 iPSCs를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 미리 코팅 된 플레이트에서 vitronectin를 흡입 하 고 줄기 세포 배양 액으로 대체 합니다. IPSC 현 탁 액을 여러 번 반전 하 여 Ipsc가 원뿔형 튜브의 바닥에 정착 하지 않았는지 확인 하 고 적절 한 서 스 펜 션 부피를 추가 하 여 새 플레이트에 세포의 1:10 희석을 제공 합니다. 분할 비율은 ipsc 성장 속도에 따라 조정 될 수 있으며,이는 iPSC 라인 들 사이에서 변할 수 있다. 플레이트를 표면에 분산 시키고 37 ° c/5% CO2의 인큐베이터에 놓습니다. 패스 에이징 후에는 iPSCs에 먹이를 준다. 2. iPSCs에서 후 각으로의 분화 제 0 일에는, 1.2 단계에서 기재한 바와 같이 vitronectin로 프리 코팅 된 10 cm 조직 배양 처리 접시에 ipscs를 분할 하 고 액티 빈 (10ng/ml)로 보충 된 줄기 세포 배양 배지를 10ml로 넣고 염기 성 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF; 12 ng/m l). 사용 하기 전에 미디어에 성장 인자를 직접 추가 하십시오. 이후의 모든 단계에서이 작업을 수행 합니다. 1 일째에 배지를 변경 하 여 배지 (줄기 세포 배양 액 10ml를 [10Ng/ml] + bFGF [12ng/ml]). 2 일째에는 배지를 다음의 성장 인자로 보충 된 10 mL 줄기 세포 배양 액으로 변경 하 여 분화를 시작 한다: 액티 빈 (100), bFGF (100 ng/m l), 골 형성 단백질 410ng/phosphoinositol 키나 제 억제제 LY294002 (10 μ m) 및 GSK3 억제제 CHIR99021 (3 μ m). 셋째 날, 액티 빈 (100 ng/ml)으로 보충 된 줄기 세포 배양 액 10 mL를 100 bFGF로 변경 하 고, LY294002 10 μ m) 및 104ng. 이 매체에 의해 유도 된 내 배 엽 사양은 다음 24 시간에 걸쳐 iPSC 콜로 니 형태에 대 한 가시적 변화를 초래 한다. 4 일째에는 액티 빈 (100 Ng/ml)과 bFGF (100 Ng/ml)로 보충 되는 10ml의 Rpmi/B27 미디어로 미디어를 변경 합니다.참고: RPMI/B27 미디어에는 L-글루타민 보충제가 포함 된 500 mL의 RPMI 배지 ( 표 1참조), 10Ml의 B27 보충제 (50 배, 세럼 불포함) 및 5 ml의 불필요 한 아미노산이 들어 있습니다. 선택 사항: 1만의 페니실린-streptomycin를 추가 하십시오. 사용 전에 필터를 소독 하십시오. 5 일째에는 액티 빈 (50 Ng/mL)으로 보충 된 10Ml/B-27 미디어를 미디어로 변경 합니다. 6 일째에, 후부 내 배 엽을 힌 더 트에 패터 닝 하기 시작 하 여, 배지를 CHIR99021 (6 μ m) + 레 틴 산 (3 μ m)으로 보충 된 10ML rpmi/B27 배지로 변경 한다. 7, 8및 9 일에 2.7 단계를 반복 합니다. 이 단계 동안, 후 각의 보이는 3 차원 구조는 플레이트의 표면을 덮고, 분명해 진다. 10 일째에는 지 하 막 매트릭스에 생성 된 힌 더 트를 포함 시킵니다 ( 재료 표참조). 3. 지하실 막 매트릭스에 힌 더 트의 임베딩 이 호 기저 성장 미디어 (500의 고급 Dulbecco의 수정 된 독수리의 배지 [DMEM]/F12, B27 보충제 10ml, 5ml(100×2 에틸) 1, 5 ml의 4, 5 밀리 (혈 청) 및 5ml(10ml)의 제 불필요 한 아미노산 [100 배]. 선택 사항: 페니실린-streptomycin 5 mL를 추가 하십시오 [1만 U/m l]; 사용 전에 필터를 소독 하십시오. 표 1참조). 힌 더 트 플레이트에서 미디어를 제거 하 고 DPBS (Ca 또는 Mg 제외)로 플레이트 1x를 씻으십시오. 상기 플레이트에 콜라 게 나 제 용액 5Ml를 넣고 5 분간 37 ° c에서 배양 한다. 콜라 게 나아 제 IV 분말 500 mg을 고급 DMEM/F12의 400 mL에 첨가 하 여 콜라 게 나아 제 용액을 생산 합니다. 그 다음에는 100 mL의 세럼 교체 ( 재료 표참조), 5ml(200 mM) 및 진단을의 3.5 μ l를 추가 하 고 용액을 섞어 줍니다. 필터-콜라 게 나아 제 분말이 완전히 용 해 되 면 용액을 멸 균 합니다.참고: 이는 최대 6 개월 동안-20°c에서 더 작은 분 취에 보관할 수 있습니다. 이 호 염기 성장 매체 5 mL를 플레이트에 첨가 하 고, 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 후 각 세포를 긁어 내어 콜라 게 나아 제를 비활성화 하 고, 15 mL 원뿔형 튜브에서 힌 트 창 자 현 탁 액을 수집 한다. 240 x g 에서 1 분간 원심 분리기를 분리 하 고 상층 액을 피 펫 팅 합니다. 10 mL의 배지를 넣고, 힌 더를 부드럽게 피 펫 팅 하 여 더 작은 조각으로 분해 하 고, 1 분간 95 x g 에서 원심 분리기를 다시 분리 합니다. 3.5 단계를 반복 하 여이 호 염기 성장 매체에서 2 배 세포를 세척 한다. 기저 성장 배지 (~ 300 ~ 500 μ l)의 소량으로 세포를 소생 하 고이 용액의 약 100 μ l를 지 하 막 매트릭스 1.5 mL에 첨가 한다. 매트릭스는 RT에서 급속 하 게 응고 되기 시작할 것 이기 때문에이 시간 동안 얼음에 남아 있어야 합니다. 37 ° c에서 플레이트 히터에 24 웰 플레이트를 설치 하 고 24 웰 플레이트의 한 우물에 60 μ l를 발견. 그것을 짧게 설정 하 고 현미경의 밑에 조밀도를 확인 하는 것을 허용 하십시오. 필요한 경우, 원하는 농도가 달성 될 때까지 증가 하는 지 하 막 매트릭스에 더 많은 힌 더 트 솔루션을 추가 하 고 나머지 웰에 용액을 발견 하십시오. 10 분 동안 37 ° c에서 배양; 이어서, 다음 농도에서 24 웰 플레이트의 각 웰에 성장 인자를 포함 하는이 호 염기 성장 매체의 800 μ l를 첨가 한다 (표 1 참조): 500 ng/m l-100 스 폰 딘, 100 ng/ml CHIR99021, 2.5 μ m 프로 스타 글란 딘 E2 및 10 μ m Y-27632 디 히드로 클로 일 수화물 (락 억제제). 2 ~ 3 일에 한 번씩 또는 미디어가 변색 되기 시작 하면 즉시이 호 기본 성장 매체를 변경 하십시오. 기저 막 매트릭스로의 초기 시 딩 후, iHOs를 분할 하기 전에 7 일 동안 개발할 수 있습니다. 3 일째 ~ 4 일에는 문화에서 뚜렷한 구체 들이 보여야 합니다. 미디어 변경만을 위해 Y-27632을 생략 하 고 분할/시드에 필요한 경우에만 필요 합니다. 4. iHOs의 유지 및 통과 점진적 해 동을 허용 하기 위해, 분할 하기 전에 24 시간 밤에 덮여 얼음 양동이에 지하실 막 매트릭스의 필요한 부피를 넣어. IHOs에서 미디어를 제거 하 고 셀 리프팅 솔루션의 500 μ l (재료 표 참조)로 교체 하십시오. 40 ~ 50 분 동안 4°c에서 배양 하 고,이 시점에서 iHOs는 용액에 떠 있어야 합니다. 선택 사항: 인-후드 이미징 시스템을 사용 하 여 원하는 형태학을 가진 iHOs만 선택 하십시오 ( 재료 표참조). IHOs를 분해 하지 않기 위해이 호/세포 리프팅 솔루션 현 탁 액을 15 mL 원추형 튜브에 부드럽게 파이 펫 합니다. IHOs가 3 ~ 5 분 동안 정착 되도록 하 고 상층 액과 단일 세포를 제거 하십시오. 이 호 염기 성장 배지의 5 mL에 iHOs를 소생 시켜 부드럽게 씻어 냅니다. 2 분 동안 95 x g 에서 원심 분리기. 후드 내에서 37 ° c의 플레이트 히터에 24 웰 플레이트를 설치 합니다. 상층 액을 제거 하 고 P1000 파이 펫을 사용 하 여 기본 성장 매체의 iHOs를 ~ 300 ~ 500 μ l로 분리 하 여 iHOs를 더 작은 덩어리로 나눕니다. 적용 해야 하는 힘은이 호 선과 성숙 상태에 따라 달라 지므로 필요에 따라 부드럽게 시작 하 여 힘을 증가 시켜야 합니다. IHOs ~ 100 μ l (부피는 용액의 밀도에 따라 다름)을 지 하 막 매트릭스의 1.5 mL로 넣고 짧게 섞어 줍니다. 지하실 막 매트릭스의 1 x 60 μ l을 24 웰 플레이트의 웰에 넣고 30 초 동안 응고 시킨 다음 현미경으로 밀도를 확인 하십시오. 밀도가 너무 낮으면 행렬에 iHOs를 더 추가 합니다. 올바른 밀도가 확보 될 때까지 4.8 단계를 반복한 다음 나머지 매트릭스를 24 웰 플레이트에 넣습니다. 37 ° c에서 10 분간 배양 기에 넣고, 3.7 단계에서 설명한 바와 같이 성장 인자를 가진 염기 성장 배지의 800 μ l로 오버레이 한다. 침략 분석 실험에 대 한 iHOs를 준비 하기 위해 (아래에 요약 됨) 단계 4.1-4.10에 기술 된 바와 같이 실험 전에 iHOs 4-5 일을 통과 시키면서 4.7 단계에서 생성 된 매트릭스이 호 용액의 120 μ l를 유리 바닥에 5 mm의 마이크로 주입 접시에 넣습니다. 일상적인 통행과 마찬가지로 액 적으로이 호 현 탁 액을 떠나기 보다는, 접시의 바닥에 물방울을 펼쳐 매트릭스의 얇은 층을 만듭니다. 2.5 mL의 기본 성장 배지와 성장 인자를 포함 합니다.참고: 항생제가 배양 배지에 사용 된 경우에, 이들은 제거 되 고 마이크로 주입 실험을 위한 비 항생제 보충 한 매체로 대체 되어야 합니다 . 5. rhIL-22로 iHOs의 프레스 IHOs에서 미디어를 흡입 하 고 침략 분석에 18 시간 전에 새로운 기본 성장 매체 (항생제를 포함 하지 않아야 함)로 대체 하십시오. 최종 농도 100 ng/mL에 rhIL-22를 배양 배지에 추가 합니다. 6. iHOs 및 세포내 침입 분석의 미세 주입 실험 전날에 S를 설정 합니다. 루 리아-베 르 타 니 브로스 10ml의 티 피 뮤 리 움 SL1344 배양을 하 고 밤새 37 ° c에서 진 탕 한다. 실험 당일 밀폐 된 열 챔버가 있는 현미경을 사용할 수 있는 경우,이를 켜고 분석을 시작 하기 전에 온도가 37 ° c에 도달 하도록 합니다. DPBS (Ca 및 Mg 함유)에서 하룻밤 세균 배양 액을 600 nm (OD600)의 광학 밀도로 희석 하 고, 그 다음에 페 놀 레드와 1:1을 섞어 줍니다. 현미경 단계에 iHOs를 포함 하는 마이크로 주입 접시를 로드 하 고, 뚜껑을 제거 하 고, 주입을 시작할 준비가 된 iHOs를 초점으로 가져옵니다. 인젝터와 arm 컨트롤 스테이션을 켜십시오. 인젝터가 600 kPa의 압력과 0.5 s의 사출 시간으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 이미 현미경 단계에서 백업 되지 않은 경우, 그것이 있는지 확인 하기 위해 주입 암을 돌립니다. 바늘에서 래핑 및 플라스틱 실린더를 제거 하 여 6 μ m 마이크로 인젝션 드릴 팁을 설정 합니다. 주입 암에서 그립 헤드를 제거 합니다. 드릴 팁을 접종 물의 10 μ l로 로드 하 고 드릴 팁을 무딘 끝에서 가볍게 파지 합니다. 드릴 팁을 그립 헤드에 넣고 마이크로 주입 암에 다시 부착 합니다. 바늘이 마이크로 주입 접시 위의 1 ~ 2cm 위치에 있도록 팔을 부드럽게 움직입니다. Arm 컨트롤을 사용 하 여 바늘 끝을 접시의 중앙에 배치 하 고 미디어 표면 바로 위에 있을 때까지 아래쪽으로 낮춥니다. 모든 주사 후이 시점에 바늘을 반환 하는 arm 제어 스테이션을 프로그래밍 합니다. IHOs에 현미경을 집중 하 고 주사 대상을 선택 합니다. 주사 되는이 호 바로 위와 오른쪽에 바늘을 위치 시켜이 호 루멘으로 바늘을 아래쪽으로 이동 시킨다. 마이크로 인젝터의 주입 버튼을 누릅니다. 페 놀-스테인드 세균 혼합물은 바늘에서 나타날 것입니다. 각이 호 3x를 주입 한다. 조건 당 최소 30 iHOs를 주입 합니다.참고: 이 호 크기 및 구조 배양 내에서의 이질성으로 인해, 변이를 제어 하기 위해 다 수의 iHOs를 주입할 필요가 있다. 필요한 모든 iHOs가 주입 되 면, 스테이지에서 마이크로 주입 판을 제거 하 고 뚜껑을 교체 하 고 90 분 동안 37 ° c에서 플레이트를 배양 합니다. 90 분 후, 성장 매체를 흡입 하 고 3 mL의 세포 리프팅 용액으로 교체 하십시오. 45 분 동안 4°c에서 배양 합니다. IHOs/세포 리프팅 용액을 DPBS 5Ml를 포함 하는 15 mL 원추형 튜브로 부드럽게 이동 시킵니다. 주입 된 모든 iHOs를 플레이트에서 제거 했는지 확인 하십시오 (필요한 경우 DPBS 1 mL로 플레이트를 헹 구 십시오). 3 분 동안 370 x g 에서 원심 분리기. 상 등 액을 제거 하 고 0.1에서 겐 타 마이 신을 함유 하는 기저 성장 배지에서 iHOs를 소생 시켰다 (1 mL의 배지를 첨가 하는 단계; 그런 다음 P1000 파이 펫 ~ 50 배를 사용 하 여 iHOs를 깨고 추가 미디어 4 mL를 첨가 하십시오). 세포 외 세균을 죽이기 위해 1 시간 동안 37 ° c에서 배양 한다. IHOs를 3 분 동안 370 x g 에서 원심 분리 하 고 상층 액을 흡입 하 여 가능한 적게 남겨 둡니다. DPBS로 iHOs 1x를 씻고 다시 원심 분리기.참고: 이 단계는 겐 타 마 신을 제거 합니다, 어떤 남아 있는 겐 타 마이 신은 일단 세포가 분해 되 면 세포내 박테리아를 죽 일 수 있으므로 중요 하다. 용 해 완충 액의 500 μ l ( 물질 표참조)에서 ihos를 소생 하 고 ~ 50 배를 피 펫 팅 하 여 유기 oid를 수동으로 해리 합니다. 이 혼합물을 RT에서 5 분간 두십시오. 얻어진 용액을 DPBS에서 순차적으로 10 배로 희석 하 여 10-1, 10-2및 10-3 농도를 생성 한다. 피 펫을 3 x 20 μ l의 액 적으로 미리 데워 진 LB 한 천 판에 희석 용액을 첨가 하였다. 37 ° c에서 밤새 배양 하 고 식민지 형성 단위 (CFU)의 콜로 니 계산 및 계산을 수행 한다. 식민지 수 세포 일차 과정에서 출시 된 세포내 박테리아의 숫자를 반영 합니다. 7. 세포 동결 및 회복 참고: 앞서 언급 한 바와 같이, iHOs를 극저온으로 보존 하 고 원할 때 다시 구성할 수 있습니다. 동결 및 융해 프로세스는 아래에 설명 되어 있습니다. 고정 하려는 iHOs의 우물을 선택 합니다. 웰에 셀 리프팅 솔루션을 추가 하 고 4°c에서 40 ~ 50 분 동안 배양 합니다. IHOs는 솔루션에 떠 있어야 합니다. 15 mL 원추형 튜브에 iHOs를 부드럽게 파이 펫 하 고 정착 할 수 있습니다. 매체를 제거 하 고 기본 성장 매체 (성장 인자 없음)로 iHOs 1x를 씻으십시오. 95 x g 에서 원심 분리기를 2 분 동안 상층 액을 제거 하 고 적절 한 부피의 세포 동결 배지로 교체 하십시오 (재료 표 참조). ihos를 극저온 바이 알로 데 운 다. 더 점진적 동결을 허용 하기 위해 하룻밤-80 ° c 냉동 기에 바이 알을 저장; 그런 다음 액체 질소 저장 장치에 전송 하십시오. IHOs를 재구성 하기 위해, 물/비드 욕조를 사용 하 여 37 ° c에서 극저온 바이 알을 급속 하 게 해 동; 그런 다음 내용물을 기본 성장 배지 10ml로 부드럽게 피 펫 합니다 (성장 인자 없음). IHOs는 신선한 기본 성장 매체의 ~ 300 μ l로 미디어를 정착 하 고 대체할 수 있습니다. IHOs를 수동으로 해리 하지 마십시오. 지 하 막 매트릭스에 iHOs를 추가 하 고 섹션 3에 설명 된 대로 그들을 밖으로 접시.