Колориметрический анализ цитратсинстого действия в Drosophila Меланогастер
概要
Мы представляем протокол для колористического асссиса цитратной активности синтазы для количественной оценки нетронутой митохондриальной массы в гомогенатах ткани Дрозофилы.
Abstract
Митохондрии играют наиболее заметную роль в клеточном метаболизме, производя АТФ через окислительную фосфорилирование и регулируя различные физиологические процессы. Митохондриальная дисфункция является основной причиной ряда метаболических и нейродегенеративных заболеваний. Intact митохондрии имеют решающее значение для их надлежащего функционирования. Фермент цитрат синтазы локализован в митохондриальной матрицы и, таким образом, может быть использован в качестве количественного маркера фермента нетронутой митохондриальной массы. Учитывая, что многие молекулы и пути, которые имеют важные функции в митохондриях, очень сохраняются между людьми и дрозофилой,и что массив мощных генетических инструментов доступны в Drosophila, Drosophila служит хорошей модельной системой для изучения митохондриальной функции. Здесь мы представляем протокол для быстрого и простого измерения активности цитрата синтазы в ткани гомегената от взрослых мух без изоляции митохондрий. Этот протокол также подходит для измерения активности цитрата синтаза в личинках, культивированных клетках и тканях млекопитающих.
Introduction
Митохондрии наиболее известны как органеллы, производящие энергию в большинстве эукариотических организмов, которые производят энергетическую валюту, АТФ, через цикл трикарбоксилевой кислоты (т.е. цикл Кребса) и окислительного фосфорилирования. Митохондрии также находятся играть важную роль во многих других физиологических процессов, таких как регулирование апоптоза1, Ca 2 “гомеостаз2,3, реактивные виды окисления (ROS) поколения4, и эндоплазмический ретикулум (ER)-стресс ответ5. Митохондриальная дисфункция может повлиять на любой орган в организме в любом возрасте и является основной причиной метаболических, связанных со старением6,и нейродегенеративных заболеваний7. Нетронутые митохондрии механистически связаны с митохондриальной функцией. Таким образом, надлежащая количественная оценка нетронутой митохондриальной массы очень важна для оценки митохондриальной функции8. Цитрат синтазы, ограничивающий скорость фермента в первой ступени цикла трикарбоксилевой кислоты9, локализуется в митохондриальной матрицы в эукариотических клетках, и, таким образом, может быть использован в качестве количественного маркера для присутствия нетронутой митохондриальной массы9,10. Активность цитрата синтазы также может быть использована в качестве фактора нормализации для нетронутых митохондриальных белков11,12.
Плодовая муха, Drosophila melanogaster, является отличной моделью системы для изучения митохондриальной функции, так как многие молекулы и пути, которые играют ключевую роль в митохондриях эволюционно сохранены от Drosophila к людям13,14,15. Здесь мы представляем протокол для быстрого и простого метода измерения активности цитрата синтазы с помощью колористического анализа в ткани Drosophila гомогенатов16 в формате 96 скважин. В цитрат синтазы деятельности анализ, цитрат синтазы в ткани Drosophila гомогената катализации реакции оксалататата с ацетил коэнзим а (ацетил КоА) для формирования цитрат CoA-SH и H. CoA-SH впоследствии реагирует с 5,5′-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (DTNB) для создания цветного продукта, 2-нитро-5-тиобензоат (TNB), который может быть легко измерен спектрофотометрически на 412 нм. Активность цитрата синтаза может быть отражена скоростью производства цвета.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метаболические исследования с использованием Drosophila в качестве модели должны принимать во внимание генетический фон, диета, и запас обслуживания мух18. Чтобы избежать воздействия различных генетических фонов на измерение активности цитрата синтаза, различные штаммы <…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами От Национального фонда естественных наук Китая (31401013 и 31471010), Научно-технической комиссии муниципалитета Шанхая, Шанхайской программы Пуцзян (14PJ1405900) и Фонда естественных наук Шанхай (19ЗР14446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
参考文献
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. 遺伝学. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!. Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson’s model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. 遺伝学. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
