초파리 멜라노가스터의 구연산 신타제 활동의 대색 분석
概要
우리는 Drosophila 조직 균질제에서 온전한 미토콘드리아 질량의 정량화를 위한 구연산염 합성 활성의 색색 분석법을 제시한다.
Abstract
미토콘드리아는 산화 인산화를 통해 ATP를 생산하고 다양한 생리적 과정을 조절함으로써 세포 대사에서 가장 중요한 역할을 합니다. 미토 콘 드리 아 기능 장애는 다양 한 신진 대사 및 신경 퇴행 성 질환의 주요 원인. 그대로 미토콘드리아는 적절한 기능에 매우 중요합니다. 효소 구연산염 신타제는 미토콘드리아 매트릭스에 국한되어 그대로 미토콘드리아 질량의 정량효소 마커로서 사용될 수 있다. 미토콘드리아에서 중요한 기능을 가진 많은 분자와 통로가 인간과 Drosophila사이에서 높게 보존된다는 것을 감안할 때, 강력한 유전 도구의 배열은 Drosophila에서유효하다는 것을, Drosophila는 미토콘드리아 기능을 공부하기 위한 좋은 모형 시스템 역할을 합니다. 여기서, 우리는 미토콘드리아를 분리하지 않고 성인 파리에서 조직 균질화에서 구연산염 합성 활성의 빠르고 간단한 측정을 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 유충, 배양 된 세포 및 포유류 조직에서 구연산염 합성 활성을 측정하는 데 적합합니다.
Introduction
미토콘드리아는 대부분의 진핵 생물에서 전력 생산 세포기관으로 가장 잘 알려져 있으며, 이는 에너지 통화인 ATP를 삼차갈래산 주기(즉, 크렙스 주기) 및 산화 인산화를 통해 생산합니다. 미토콘드리아는 또한 세포사멸1,Ca2+ 항상성2,3,반응성 산화 종(ROS)4세대및 내포성 망상(ER)-스트레스반응의조절과 같은 많은 다른 생리적 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 미토콘드리아 기능 장애는 모든 연령대의 신체에 영향을 미칠 수 있으며 대사, 노화 관련6및 퇴행성 신경 질환의 주요 원인입니다7. 본래 미토콘드리아는 미토콘드리아 기능과 기계적으로 관련이 있습니다. 따라서, 미토콘드리아 질량의 적절한 정량화는 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 매우 중요하다8. 구연산 신타제는 트리카르복실산 주기9의제1단계에서 속도 제한 효소로서, 진핵 세포 내의 미토콘드리아 매트릭스에 국한되어 있으며, 따라서 그대로 미토콘드리아 질량9,10의존재에 대한 정량적 마커로서 사용될 수 있다. 구연산염 합성 활성은 또한 온전한 미토콘드리아 단백질11,12에대한 정상화 인자로 사용될 수 있다.
열매 파리, Drosophila melanogaster는미토콘드리아에서 중추적 인 역할을하는 많은 분자 및 경로가 진화적으로 인간13,14,15로보존되기 때문에 미토콘드리아 기능을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 여기서, 우리는 96웰 플레이트 포맷에서16개의 동질성 혈색 분석법에 의한 구연산염 합성 활성의 측정을 위한 빠르고 간단한 방법을 제시한다. 구연산염 합성 활성 분석에서, 구연산염 합성효소는 초파리 조직에서 동질화 촉매 작용을 아세틸 코엔자임 A(아세틸 CoA)와 함께 옥살로아세테이트의 반응을 형성하여 구연산염 CoA-SH 및H+를형성한다. CoA-SH는 이어서 5,5′-디티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB)와 반응하여 412 nm에서 분광광도 측정을 쉽게 측정할 수 있는 2-니트로-5-티오벤조에이트(TNB)의 유색 생성제품을 생성합니다. 구연산염 합성 활성은 색상 생산의 속도에 의해 반영될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila를 모델로 사용하는 신진 대사 연구는 파리의 유전적 배경, 식단 및 재고 유지 를 고려해야합니다18. 구연산염 합성 활동의 측정에 다른 유전 적 배경의 영향을 피하기 위해, 초파리의 다른 변종은 10 세대에 대한 제어 균주에 역교차되어야한다. 우리의 실험에 사용된 모든 Drosophila 긴장의 유전 배경은 w1118입니다,그래서 우리는 대조군으?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31401013 및 31471010), 상하이 시 과학 기술위원회, 상하이 푸장 프로그램 (14PJ1405900), 그리고 자연 과학 재단의 보조금에 의해 지원되었다 상하이 (19ZR1446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
参考文献
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