الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر
概要
نحن نقدم بروتوكولا لفحص ألوان من النشاط synthase سيترات للقياس الكمي من كتله الميتوكوندريا سليمه في الانسجه المتجانسة .
Abstract
الميتوكوندريا تلعب الأدوار الأكثر بروزا في الأيض الخلوية عن طريق إنتاج ATP من خلال فوسفولات الاكسده وتنظيم مجموعه متنوعة من العمليات الفسيولوجية. خلل الميتوكوندريا هو السبب الرئيسي لعدد من الامراض الايضيه والعصبية. الميتوكوندريا سليمه هي حاسمه لأداءها السليم. يتم تعريب سيترات الانزيم synthase في مصفوفة الميتوكوندريا التالي يمكن استخدامها كعلامة انزيم الكمية من كتله الميتوكوندريا سليمه. النظر إلى ان العديد من الجزيئات والمسارات التي لها وظائف هامه في الميتوكوندريا يتم الحفاظ عليها بشكل كبير بين البشر و دروفيسيلا، وان هناك مجموعه من الاداات الجينية القوية متوفرة في دروفيا، فان دروفيسيلا تعمل كنظام نموذجي جيد لدراسة وظيفة الميتوكوندريا. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لقياس سريع وبسيط من النشاط synthase سيترات في المتجانسات الانسجه من الذباب الكبار دون عزل الميتوكوندريا. هذا البروتوكول هو أيضا مناسبه لقياس النشاط synthase سيترات في اليرقات, الخلايا المستزرعة, وانسجه الثدييات.
Introduction
الميتوكوندريا هي المعروفة باسم العضوية المنتجة للطاقة في معظم الكائنات الحية النواة ، والتي تنتج العملة الطاقة ، ATP ، من خلال دوره حمض تريكاربوكسيليك (اي ، دوره كريبس) والاكسده فوسفولات. ووجدت الميتوكوندريا أيضا للعب ادوار هامه في الكثير من العمليات الفسيولوجية الأخرى, مثل تنظيم المبرمج1, Ca2 + التوازن2,3, أنواع الاكسده التفاعلية (ROS) جيل4, والشبكية إندوبلازمي (ER)-استجابه الإجهاد5. الخلل الميتوكوندريا يمكن ان تؤثر علي اي عضو في الجسم في اي عمر وهو السبب الرئيسي لاستقلاب, الشيخوخة المرتبطة6, وامراض الأعصاب7. الميتوكوندريا سليمه ذات الصلة ميكانيكيه إلى وظيفة الميتوكوندريا. التالي, التحديد الكمي السليم للكتلة الميتوكوندريا سليمه مهم جدا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا8. Synthase سيترات, انزيم الحد من معدل في الخطوة الاولي من دوره حمض تريكاربوكسيليك9, مترجمه في مصفوفة الميتوكوندريا داخل الخلايا النواة, التالي يمكن استخدامها كعلامة كميه لوجود كتله الميتوكوندريا سليمه9,10. سيترات synthase النشاط يمكن أيضا ان تستخدم كعامل تطبيع للبروتينات الميتوكوندريا سليمه11,12.
ذبابه الفاكهة ، دروكوفيلا ميلغاستر، هو نظام نموذجي ممتاز لدراسة وظيفة الميتوكوندريا ، كما العديد من الجزيئات والمسارات التي تلعب دورا محوريا في الميتوكوندريا يتم الحفاظ عليها تطوريا من دروفيبيلا إلى البشر13،14،15. هنا ، نقدم بروتوكولا لطريقه سريعة وبسيطه لقياس النشاط synthase سيترات بواسطة فحص الملونة في الانسجه دروفيا المتجانسات16 في شكل لوحه جيد 96. في اختبار النشاط سينثاز سيترات ، synthase سيترات في الانسجه المتجانسة في دروفيسيلا يحفز رد فعل اوكسالوخلات مع انزيم اسيتيل A (اسيتيل coa) لتشكيل سيترات COA-SH وH +. CoA-SH يتفاعل لاحقا مع 5 ، 5 ‘-dithiobis-(2-حمض نيتروبنزويك) (DTNB) لتوليد منتج ملون ، 2-نيترو-5-ثيوبنزواتي (TNB) ، والتي يمكن قياسها بسهوله فوتومتر في 412 nm. يمكن ان ينعكس نشاط synthase سيترات بمعدل إنتاج ألوان.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجب ان تاخذ الدراسات الايضيه التي تستخدم دروفيسيلا كنموذج في الاعتبار الخلفية الوراثية ، والنظام الغذائي ، وصيانة المخزون من الذباب18. لتجنب اثار الخلفيات الوراثية المختلفة علي قياس النشاط synthase سيترات ، يجب ان تكون السلالات المختلفة من دروكوفيلا إلى سلاله السيطرة ?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما بالمنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31401013 و 31471010) ، ولجنه العلوم والتكنولوجيا التابعة لبلديه شنغهاي ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (14PJ1405900) ، ومؤسسه العلوم الطبيعية التابعة شنغهاي (19ZR1446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
参考文献
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. 遺伝学. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!. Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson’s model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. 遺伝学. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
