Strategie non invasive per la manipolazione cronica dell'attività neuronale controllata da DREADD
概要
Qui descriviamo due metodi non invasivi per controllare cronicamente l’attività neuronale usando la chemiogenetica nei topi. Le gocce oculari sono state utilizzate per fornire ogni giorno clozapina-n-ossido (CNO). Descriviamo anche due metodi per una somministrazione prolungata di CNO nell’acqua potabile. Queste strategie per il controllo neuronale cronico richiedono un intervento minimo riducendo lo stress degli animali.
Abstract
Le strategie chemiogenetiche sono emerse come strumenti affidabili per il controllo remoto dell’attività neuronale. Tra questi, i recettori dei progettisti attivati esclusivamente da farmaci di design (DREADD) sono diventati l’approccio chemiogenetico più popolare utilizzato nelle neuroscienze moderne. La maggior parte degli studi fornisce il ligando clozapina-n-ossido (CNO) utilizzando una singola iniezione intraperitoneale, che è adatto per l’attivazione/inibizione acuta della popolazione neuronale mirata. Ci sono, tuttavia, solo alcuni esempi di strategie per la modulazione cronica dei neuroni controllati da DREADD, la maggior parte dei quali si basano sull’uso di sistemi di consegna che richiedono un intervento chirurgico. Qui, espandiamo su due strategie non invasive per fornire il Ligand CNO per manipolare cronicamente la popolazione neurale nei topi. Il CNO è stato somministrato sia utilizzando gocce oculari ripetitive (giornaliere), sia cronicamente attraverso l’acqua potabile dell’animale. Questi paradigmi non invasivi si traducono in una robusta attivazione dei recettori dei progettisti che persistevano in tutti i trattamenti CNO. I metodi qui descritti offrono alternative per il controllo mediato cronico danzico danzico dell’attività neuronale e possono essere utili per esperimenti progettati per valutare il comportamento in animali liberamente in movimento, concentrandosi su metodi di somministrazione CNO meno invasivi.
Introduction
I progressi tecnici nel campo delle neuroscienze hanno permesso agli scienziati di identificare e controllare con precisione l’attività di particolari popolazioni neuronali1. Questo ha contribuito a comprendere meglio la base dei circuiti neuronali e il loro impatto sul comportamento animale, così come, rivedendo i dogmi stabiliti2,3. Tra questi nuovi strumenti, le strategie optogenetiche e chemiogenetiche hanno avuto un profondo impatto non solo sulla qualità delle scoperte, ma anche sul modo in cui gli esperimenti sono concepiti e progettati4. Nel presente manoscritto, ci concentriamo sulle strategie chemiogenetiche per controllare l’attivazione dei neuroni tramite strategie ingegnerizzate recettore-ligando. Recettori di design attivati esclusivamente da farmaci di design (DREADDs) rappresentano uno degli strumenti chemiogenetici più popolari per il controllo remoto dell’attività neuronale, come esaminato da Roth 20165. I DREADD utilizzano recettori acetilline muscarinic modificati che sono specificamente attivati da un ligando inerte, clozapina-n-ossido (CNO)6.
Maggior parte degli studi utilizzano CNO somministrato da iniezioni intraperitoneali (i.p.), che controlla efficacemente il dosaggio e la tempistica dei recettori ingegnerizzati attivazione in modo acuto. Tuttavia, quando è necessaria l’attivazione ReREADD ripetitiva o cronica, l’uso di iniezioni multiple i.p. diventa irrealizzabile. Per risolvere questo problema, sono state segnalate diverse strategie per la consegna cNO cronica, tra cui minipumps7 impiantate e cannule intracraniche8,9. In misura diversa, tutte queste strategie causano agli animali stress e dolore10e richiedono un intervento chirurgico che potrebbe anche avere un impatto diretto sulle risposte comportamentali da testare11. Qui, descriviamo tre strategie non invasive per la consegna cNO cronica.
A questo scopo, i topi sono stati iniettati stereotassicamente nell’ippocampo con un virus adeno-associato (AAV) che codifica una versione ingegneristica del recettore muscarinico M3 eccitatorio (hM3Dq) che quando attivato dal ligando CNO porta alla cottura a raffica di neuroni6. È stato precedentemente dimostrato che un singolo occhio contenente CNO può effettivamente suscitare una robusta attivazione di neuroni che esprimono DREADD12. Qui descriviamo un metodo modificato per la consegna ripetitiva di colliri. Per ottenere un controllo cronico e sostenuto dei recettori dei progettisti, descriviamo quindi una strategia non invasiva per fornire CNO ai topi attraverso l’acqua potabile. Infine, descriviamo un paradigma alternativo per fornire CNO in acqua potabile durante una finestra temporale limitata. L’attività locomotoria dei topi, così come il comportamento di bere e il consumo di soluzioni caloriche dolci, sono per lo più limitate alla parte scura del ciclo luce / scuro13,14. Pertanto, abbiamo adottato un protocollo basato sulla preferenza del topo per il saccarosio. Misurando l’induzione del gene immediatamente precoce c-Fos nelle cellule infettate da AAV, come lettura per l’attivazione neuronale12,15, abbiamo scoperto che queste strategie di erogazione CNO attivano in modo robusto i neuroni controllati da DREADD Durate.
Protocol
Representative Results
Discussion
I DREADD sono emersi come un approccio popolare ed efficace per manipolare da remoto l’attività neuronale17. La progettazione di strategie alternative per la consegna di CNO aumenterà ampiamente lo spettro delle opzioni disponibili per specifiche impostazioni sperimentali. Inoltre, le strategie non invasive per la consegna di CNO riducono al minimo qualsiasi potenziale interpretazione errata dei risultati riducendo gli effetti collaterali negativi che possono avere un impatto diretto sulla salut…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di ricerca intramurale presso l’Istituto Nazionale di Salute Mentale (Istituto Nazionale di Salute Mentale). Ringraziamo il sostegno del NIMH IRP Rodent Behavioral Core(
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
参考文献
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. . Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. 神経科学. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
