Este protocolo detalha um procedimento em que as culturas neuronal humanas são transadas com construções lentivirais que codificam para o Tau humano do mutante. As culturas transadas exibem agregados Tau e patologias associadas.
A agregação aberrante da proteína Tau é patogenicamente envolvida em um número de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD). Embora os modelos de rato de Taupatia forneceram um recurso valioso para investigar os mecanismos neurotóxicos da Tau agregada, está tornando-se cada vez mais aparente que, devido às diferenças do entre espécies na neurofisiologia, o cérebro do rato é inadequado para modelar a condição humana. Os avanços nos métodos de cultura celular tornaram as culturas neuronais humanas acessíveis para uso experimental in vitro e ajudaram no desenvolvimento de neuroterapêutica. No entanto, apesar da adaptação de culturas de células neuronais humanas, in vitro modelos de tauopatia humana ainda não estão amplamente disponíveis. Este protocolo descreve um modelo celular da agregação da Tau em que os neurônios humanos são transfundidos com os vetores lentiviral-derivados esse código para Tau patogenicamente mutado fundido a um repórter amarelo da proteína fluorescente (YFP). Culturas transdoadas produzem agregados Tau que mancham positivamente para a tioflavina e exibem marcadores de neurotoxicidade, tais como diminuição do comprimento axonal e aumento do volume lisossomal. Este procedimento pode ser um modelo útil e rentável para estudar tauopathies humanas.
A agregação patológica da proteína Tau microtubule-associada é uma característica definidora de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a AD, a demência frontotemporal (FTD), a doença de pick, e a paralisia supranuclear progressiva (PSP)1. Em um estado não-doente, a Tau liga-se e estabiliza os filamentos de microtúse em axônios neuronais2. No entanto, a hiperfosforilação associada à doença da Tau promove a agregação de Tau, a dissociação dos microtúbulos e a toxicidade neuronal3. Os efeitos tóxicos da Tau agregada podem envolver a ativação aberrante de4 e receptores glutamatérgicos colinérgicos5 resultando na desregulação do cálcio intracelular e, eventualmente, morte celular. Em modelos animais, a redução da Tau cerebral melhora a patologia em camundongos AD6 e em modelos de mouse de lesão cerebral traumática leve repetitiva7.
A evidência da montagem demonstra que a estrutura e a afinidade obrigatória da Tau rato-derivada são distintas da Tau Human-derivada e que o Tau do rato é inadequado para modelar Tauopatias humanos8. Entretanto, os modelos Taupatia da pilha humana não são extensamente disponíveis comercialmente. O objetivo geral deste trabalho é descrever um modelo in vitro de agregação Tau em que os neurônios humanos são transviados com vetores derivados de lentivirais contendo construções de Tau humanas mutantes9. Tau agregado causando lentivirais constrói codifica para o domínio de repetição Tau abrigando P301L e V337M mutações fundidas a um repórter YFP (Tau-rdlm-YFP) enquanto o controle constrói código para o Wild-Type (WT) Tau repetir domínio fundido a um repórter YFP (Tau-WT-YFP). As culturas neuronal transectoadas usando este método expressam aproximadamente nove vezes mais Tau do que culturas nontransemadas. Embora a quantidade de expressão de Tau superexpressa seja aproximadamente igual entre as células Tau-RDLM-YFP-e Tau-WT-YFP-transvadas, apenas os neurônios transvados com agregados de exibição de Tau-RDLM-YFP. As culturas transvadas com Tau-RDLM-YFP mancham positivamente para a tioflavina e apresentam reduções no comprimento axonal e na densidade sináptica. Portanto, este modelo celular pode ser uma ferramenta útil para estudar a agregação de Tau in vitro.
Este protocolo descreve a geração de um modelo in vitro de Taupatia humano que exiba agregados prata-mancha-positivos e emaranhados neurofibrilary thioflavin-positivos (NFTS). Além disso, as pilhas transfuídas exibem patologias Tau-induzidas tais como defeitos morfológicos, synaptogenesis reduzido, e um volume lysosomal aumentado. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece um modelo acessível e rentável de tauopatia neuronal, que pode ser usado para estudos de triagem de drogas, bem como para a análi…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Peter Davies no Albert Einstein College of Medicine por fornecer anticorpos PHF-1 e CP13 e Dr. Marc Diamond na Universidade do Texas, no sudoeste, por fornecer os constructos Tau. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Associação de Alzheimer (NIRG-14-322164) para S.H.Y. e do Instituto de medicina regenerativa da Califórnia (TB1-01193) para P.R.
10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
Cell culture incubator | Various sources | NA | |
Centrifuge | Various sources | NA | |
DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
Human neural stem cells | Various sources | NA | |
Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
Water bath | Various sources | NA |