Un modelo in vitro para estudiar la agregación de Tau utilizando la transducción de neuronas humanas mediada por lentivirales
概要
Este protocolo detalla un procedimiento en el que las culturas neuronales humanas son transducidas con construcciones lentivirales codificando para tau humano mutante. Las culturas transducadas muestran agregados Tau y patologías asociadas.
Abstract
La agregación aberrante de la proteína tau está implicada patogénicamente en una serie de enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (AD). Aunque los modelos de tauopatía de ratón han proporcionado un recurso valioso para la investigación de los mecanismos neurotóxicos de la Tau agregada, es cada vez más evidente que, debido a las diferencias interespecies en Neurofisiología, el cerebro del ratón es inadecuado para modelar la condición humana. Los avances en los métodos de cultivo celular han hecho que las culturas neuronales humanas sean accesibles para uso experimental in vitro y han ayudado en el desarrollo de neuroterapias. Sin embargo, a pesar de la adaptación de las culturas celulares neuronales humanas, los modelos in vitro de la tauopatía humana aún no están ampliamente disponibles. Este protocolo describe un modelo celular de agregación de tau en el que las neuronas humanas son transducadas con vectores de origen lentiviral que codifica para tau mutado patógeno fusionado a un reportero de proteína fluorescente amarilla (YFP). Las culturas transducadas producen agregados tau que se mancha positivamente para la tioflavina y muestran marcadores de neurotoxicidad, como la longitud axonal disminuida y el aumento del volumen lisosomal. Este procedimiento puede ser un modelo útil y rentable para el estudio de las tauopatías humanas.
Introduction
La agregación patológica de la proteína tau asociada a un microtúbulo es una característica definitoria de muchas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la AD, la demencia frontotemporal (FTD), la enfermedad de Pick y la parálisis la supranuclear progresiva (PSP)1. En un estado no enfermo, Tau se une y estabiliza los filamentos de microtúbulo en axones neuronales2. Sin embargo, la hiperfosforilación asociada a la enfermedad de Tau promueve la agregación de TAU, la disociación de los microtúbulos y la toxicidad neuronal3. Los efectos tóxicos de Tau agregada pueden implicar la activación aberrante de colinérgicos4 y los receptores glutamatérgicos5 resultando en la desregulación del calcio intracelular y, eventualmente, la muerte celular. En modelos animales, la reducción de Tau cerebral mejora la patología en ratones AD6 y en modelos de ratón de lesión cerebral traumática leve repetitiva7.
La evidencia de montaje demuestra que la estructura y la afinidad de unión de Tau derivado del ratón son distintas de Tau derivado del humano y que Tau de ratón es inadecuado para modelar Tauopatías humanas8. Sin embargo, los modelos de tauopatía celular humana no están ampliamente disponibles comercialmente. El objetivo general de este trabajo es describir un modelo in vitro de agregación tau en el que las neuronas humanas son transducidas con vectores de origen lentiviral que contienen construcciones tau humanas mutantes9. El agregado de tau que hace que las construcciones lentivirales se codifiquen para el dominio de repetición tau P301L y V337M mutaciones fusionadas con un reportero de YFP (tau-RDLM-YFP) mientras que el control construye el código para el dominio de repetición de Tau (WT) de tipo salvaje fusionado con un reportero de YFP (tau-WT-YFP). Los cultivos neuronales transducidas usando este método expresan aproximadamente nueve veces más tau que las culturas no transducadas. Aunque la cantidad de expresión de Tau expresada en exceso es aproximadamente igual entre las células de Tau-RdlM-YFP y tau-WT-YFP-transducidas, solo las neuronas transducidas con agregados de visualización tau-RdlM-YFP. Las culturas transladadas con tau-RDLM-YFP se mancha positivamente para tioflavina y muestran reducciones en la longitud axonal y la densidad sináptica. Por lo tanto, este modelo celular puede ser una herramienta útil para estudiar la agregación de Tau in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la generación de un modelo in vitro de tauopatía humana que exhibe agregados de plata-mancha positiva y ovillos neurofibrilares positivos de tioflavina (NFTs). Además, las células transducadas muestran patologías inducidas por TAU, como defectos morfológicos, reducción de la sinaptogénesis y un aumento del volumen lisosomal. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona un modelo accesible y rentable de la tauopatía neuronal, que se puede utilizar para los estudios de detecci?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores le agradecen al Dr. Peter Davies en el Albert Einstein College of Medicine por suministrar anticuerpos PHF-1 y CP13 y al Dr. Marc Diamond en la Universidad de Texas, Southwestern, por proveer las construcciones tau. Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación de Alzheimer (NIRG-14-322164) a S.H.Y. y del Instituto de Medicina Regenerativa de California (TB1-01193) a P.R.
Materials
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
参考文献
- Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).
- Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
- Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
- DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).
- Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).
- Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).
- Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
- Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
- Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).
- Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).
- Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).
