Модель in экстракорпоральное для изучения агрегация Тау с использованием ленто-вирусно-опосредованное производство нейронов человека
概要
Этот протокол детализирует процедуру, в которой нейронные культуры человека преобразуются с лентивирусными конструкциями, кодирующие для мутантного человека Тау. Трансдуктед культур отображения Тау агрегатов и сопутствующих патологий.
Abstract
Аберрантное агрегирование белка Тау патогенично участвует в ряде нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (AD). Хотя мышиные модели толопатии предоставили ценный ресурс для исследования нейротоксических механизмов агрегированного Тау, становится все более очевидным, что из-за межвидовой разницы в нейрофизиологии, мозг мыши непригоден для моделирования состояния человека. Достижения в области клеточной культуры сделали человека нейрональных культур доступны для экспериментального использования в пробирке и способствовали развитию нейротерапии. Однако, несмотря на адаптацию человеческих нейрональных клеточных культур, в пробирке модели человеческой таулопатии еще не широко доступны. Этот протокол описывает клеточную модель агрегации Тау, в которой человеческие нейроны преобразуются с лентивирусными векторами, которые кодируют патогенически мутировавшего Тау, сплавленного в репортера желтого флуоресцентного белка (YFP). Трансдукд культур производят Тау агрегатов, что пятно положительно для тиофлавина и отображения маркеров нейротоксичности, такие как снижение длины аксонов и увеличение лизосомальный объем. Данная процедура может быть полезной и рентабельной моделью для изучения человеческих тауопатий.
Introduction
Патологическая агрегация микротрубочек связанных белка Тау является определяющей чертой многих нейродегенеративных заболеваний, в том числе AD, фронтовисочной деменции (FTD), болезнь пика, и прогрессивный надъядерного паралич (PSP)1. В небольное состояние, Тау связывается и стабилизирует микротрубочек нитей в нейрональных аксонов2. Однако, связанное с болезнью гиперфосфорилирование Тау способствует агрегацию Тау, диссоциации из микротрубочек и нейрональной токсичности3. Токсическое воздействие агрегированного Тау может включать аномальную активацию холинергических4 и глутаматергических рецепторов5 , приводящее к регуляции внутриклеточного кальция и, в конечном счете, клеточной смерти. В моделях животных, снижение мозга Тау улучшает патологии в мышах AD6 и в мышах моделей повторяющихся мягкой черепно-мозговой травмой7.
Монтаж доказательств свидетельствует о том, что структура и обязательным сродство мыши полученных Тау отличаются от человека, полученных Тау и что мышь Тау непригодна для моделирования человеческих тауопатий8. Тем не менее, человеческие клетки таулопатии модели не являются широко коммерчески доступными. Общая цель этой работы состоит в том, чтобы описать в пробирке модель агрегация Тау, в которой человеческие нейроны преобразуются с лентивирусных производных векторов, содержащих мутантные человеческие конструкции Тау9. Тау совокупности вызывает лентивирусные конструкции кодирует для Тау повторить домен укрывательство P301L и V337M мутаций, слиты с корреспондентом YFP (Тау-RDDM-YFP), а Управление строит код для дикого типа (ДФ) Тау повторить домен сливается с репортер YFP (Тау-т-YFP). Нейронные культуры трансдукты с помощью этого метода выражают примерно в девять раз больше Тау, чем нетрансдукты культур. Хотя количество выражения Тау чрезмерно выражено примерно равным между Тау-РДМ-ИФФ-и Тау-т-ЗПС-трансдукзные клетки, только нейроны трансдукты с дисплеем Тау-РДМ-YFP агрегаты. Культур преобразователи с Тау-РДМ-YFP пятно положительно для тиофлавина и отображения сокращений в аксональной длины и синаптической плотности. Таким образом, эта клеточная модель может быть полезным инструментом для изучения агрегация Тау в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает поколение в пробирке модель человеческой тауопатии, что экспонаты серебра-пятно-позитивные агрегаты и Тиофлавин-положительных нейрофибриллярных связок (Нфтс). Кроме того, трансдукты клеток отображения Тау-индуцированных патологий, таких как морфологические д…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Питер Дэвис в Альберт Эйнштейн колледж медицины для поставки PHF-1 и CP13 антител и д-р Марк Diamond в Техасском университете, Юго-Западный, за предоставление Тау конструкций. Эта работа была поддержана гранты Ассоциации Альцгеймера (НИРГ-14-322164) в С.Х.И. и из Калифорнийского института регенеративной медицины (TB1-01193) для PR
Materials
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
参考文献
- Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).
- Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
- Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
- DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).
- Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).
- Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).
- Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
- Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
- Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).
- Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).
- Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).
