Ein In-Vitro-Modell für das Studium der Tau Aggregation mit Lentiviral-vermittelter Transkription menschlicher Neuronen
概要
In diesem Protokoll wird ein Verfahren beschrieben, bei dem menschliche neuronale Kulturen mit Linsenkonstrukten übertragen werden, die für mutwillige menschliche Tauben kodieren. Durchgeführte Kulturen zeigen Tau-Aggregate und damit verbundene Pathologien.
Abstract
Die Aberrante Aggregation des Proteintau ist pathogenisch an einer Reihe neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt, darunter die Alzheimer-Krankheit (AD). Obwohl Mausmodelle der Tauopathie eine wertvolle Ressource für die Untersuchung der neurotoxischen Mechanismen des aggregierten Tau zur Verfügung gestellt haben, wird immer deutlicher, dass das Maushirn aufgrund der Unterschiede zwischen den Arten in der Neurophysiologie ungeeignet ist. Modellierung des menschlichen Zustandes. Fortschritte in den Methoden der Zellkultur haben menschliche neuronale Kulturen für den experimentellen Einsatz in vitro zugänglich gemacht und bei der Entwicklung der Neurotherapie geholfen. Trotz der Anpassung der menschlichen neuronalen Zellkulturen sind In-vitro-Modelle menschlicher Tauopathie aber noch nicht weit verbreitet. Dieses Protokoll beschreibt ein zelluläres Modell der Tau-Aggregation, in dem menschliche Neuronen mit Linsenvektoren transferiert werden, die für pathogenisch mutierte Tau kodieren, die zu einem gelben Fluoreszenzprotein (YFP)-Reporter verschmolzen sind. Durchgeführte Kulturen produzieren Tau-Aggregate, die positiv für Thioflavin und Anzeige von Markern der Neurotoxizität, wie verminderte axonale Länge und erhöhte lysosomale Volumen. Dieses Verfahren kann ein nützliches und kostengünstiges Modell für die Untersuchung menschlicher Tauopathien sein.
Introduction
Die pathologische Aggregation des mikrotubule-assoziierten Proteintau ist ein prägendes Merkmal vieler neurodegenerativer Erkrankungen, darunter AD, frontotemporale Demenz (FTD), Pick es Krankheit und progressive supranuclear Lähmung (PSP) 1. In einem nicht erkrankten Zustand bindet tau Mikrotubule-Filamente in neuronalen Axonen2und stabilisiert sie. Die krankheitsbedingte Hyperphosphoryation von Tau fördert jedoch die Tau-Aggregation, die Trennung von Mikrotubuli und die neuronale Toxizität 3. Die toxischen Wirkungen des aggregierten Tau können eine aberzogeneAktivierung von cholinergen 4 und glutamatergischen Rezeptoren5 beinhalten, die zu einer Dysregulation von intrazellulärem Kalzium und schließlich zum Zelltod führen. In Tiermodellen verbessert die Reduktion des Hirntau die Pathologiebei AD-Mäuse 6 und bei Mausmodellen der sich wiederholendenmilden traumatischen Hirnverletzung 7.
Montierende Beweise zeigen, dass sich die Struktur und die Bindungsaffinität von Maus-Tau von der vom Menschen abgeleiteten Taube unterscheiden und dass die Maus tau für die Modellierung menschlicher Tauopathien ungeeignet ist. Menschliche Zelltauopathie-Modelle sind jedoch nicht weit verbreitet. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, ein In-vitro-Modell der Tau-Aggregation zu beschreiben, in dem menschliche Neuronen mit liniviralen Vektoren übertragen werden, die mutierende menschlicheTau-Konstrukte 9 enthalten. Tau Aggregat verursacht Linziviralkonstrukte für die Tau-Wiederholungsdomäne P301L und V337M Mutationen, die zu einem YFP-Reporter verschmolzen sind (Tau-R@ DLM-YFP) während der Steuerung den Code für die Wild-typ (Wt) tau-wiederholen Domain, die mit einem YFP-Reporter (Tau-Wt-YFP) verschmolzen ist. Neuronale Kulturen, die mit dieser Methode transduced werden, drücken etwa neunmal mehr Tau aus als nicht übertragene Kulturen. Obwohl die Menge der überdrückten Tau-Expressions-Expression in etwa gleich ist zwischen Tau-RDLM-YFP-und Tau-Wt-YFP-übertragenen Zellen, werden nur Neuronen mit Tau-RDLM-YFP-Displayaggregaten übertragen. Die Kulturen, die mit Tau-RDLM-YFP-Fleck positiv für Thioflavin übertragen werden, zeigen eine Reduktion der axonalen Länge und der synaptischen Dichte. Daher kann dieses zelluläre Modell ein nützliches Werkzeug sein, um die Tau-Aggregation in vitro zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Generierung eines In-vitro-Modells menschlicher Tauopathie, das silberfarbene Flecken positive Aggregate und Thioflavin-positive neurofibrilläre Tangles (NFTs) aufweist. Darüber hinaus weisen die übertragenen Zellen tau-induzierte Pathologien wie morphologische Defekte, eine reduzierte Synaptogenese und ein erhöhtes lysosomales Volumen auf. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es ein zugängliches und kostengünstiges Modell der neuronalen Tauopathie bietet, das sowoh…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Peter Davies vom Albert Einstein College of Medicine für die Lieferung von PHF-1 und CP13-Antikörpern und Dr. Marc Diamond an der University of Texas, im Südwesten, für die Bereitstellung der Tau-Konstrukte. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der Alzheimer es Association (NIRG-14-322164) an S.H.Y. und des California Institute for Regenerative Medicine (TB1-01193) an P.R.
Materials
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
参考文献
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