Microscopia di tracciamento a singola molecola - Uno strumento per determinare gli stati diffusivi delle molecole citosoliche

L’esame del comportamento diffuso delle biomolecole fornisce informazioni sulle loro funzioni biologiche. Le tecniche basate sulla microscopia a fluorescenza sono diventate strumenti preziosi per osservare le biomolecole nel loro ambiente cellulare nativo. Il recupero della fluorescenza dopo la fotobleaching (FRAP) e la spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS)¹ forniscono comportamenti diffusischi con la media dell’insieme. Al contrario, la microscopia di localizzazione a singola molecola consente l’osservazione di singole molecole fluorescenti con alta risoluzione spaziale e temporale^2,3,4. Osservare singole molecole è vantaggioso poiché una proteina di interesse può esistere in diversi stati diffusivi. Ad esempio, due stati diffusivi facilmente distinguibili sorgono quando un regolatore trascrizionale, come CueR in Escherichia coli, si diffonde liberamente nel citosol o si lega a una sequenza di DNA e diventa immobilizzato sulla scala cronologica della misurazione⁵ . Il tracciamento a singola molecola fornisce uno strumento per osservare direttamente questi diversi stati e non sono necessarie analisi sofisticate per risolverli. Tuttavia, diventa più difficile risolvere più stati diffusi e le loro frazioni di popolazione nei casi in cui i loro tassi di diffusione sono più simili. Ad esempio, a causa della dipendenza dalle dimensioni del coefficiente di diffusione, i diversi stati di oligomerizzazione di una proteina si manifestano come diversi stati diffusivi^{6,7,8,9 , 10}. Tali casi richiedono un approccio integrato in termini di acquisizione, trattamento e analisi dei dati.

Un fattore critico che influenza i tassi diffusivi delle molecole citosoliche è l’effetto del confinamento attraverso il confine cellulare. Le restrizioni imposte al movimento molecolare da un confine cellulare batterico fanno sì che il tasso di diffusione misurato di una molecola citononica appaia più lenta rispetto a quando lo stesso movimento si fosse verificato in uno spazio non confinato. Per le molecole che si difcizzano molto lentamente, l’effetto del confinamento cellulare è trascurabile a causa della mancanza di collisioni con il confine. In questi casi, può essere possibile risolvere con precisione gli stati diffusivi adattando le distribuzioni di spostamenti molecolari, ro coefficienti di diffusione apparente, D ,utilizzando modelli analitici basati sulle equazioni per il moto browniano ( diffusione casuale)^11,12,13. Tuttavia, per la rapida comfazione delle molecole citosoliche, le distribuzioni sperimentali non assomigliano più a quelle ottenute per il moto browniano non confinato a causa di collisioni di molecole che diffondevano i confini cellulari. Gli effetti di confinamento devono essere presi in considerazione per determinare con precisione i coefficienti di diffusione non confinati delle molecole fluorescenti. Recentemente sono stati sviluppati diversi approcci per tenere conto degli effetti di confinamento (semi-)analiticamente ^5,14,15,16 o numericamente attraverso simulazioni Monte Carlo di Diffusione browniana^{6,10,16,17,18,19}.

Qui, forniamo un protocollo integrato per la raccolta e l’analisi dei dati di microscopia di localizzazione a singola molecola con particolare attenzione al tracciamento a singola molecola. L’obiettivo finale del protocollo è quello di risolvere gli stati diffusivi di proteine citosoliche fluorescenti all’interno, in questo caso, cellule batteriche a forma di asta. Il nostro lavoro si basa su un protocollo precedente per il tracciamento a singola molecola, in cui una polimerasi di DNA, PolI, ha dimostrato di esistere in uno stato legato al DNA e non legato dall’analisi di diffusione²⁰. Qui, espandiamo l’analisi di tracciamento a singola molecola a misurazioni 3D ed eseguiamo simulazioni computazionali più realistiche per risolvere e quantificare più stati diffusi contemporaneamente presenti nelle cellule. I dati vengono acquisiti utilizzando un microscopio a fluorescenza a super-risoluzione 3D costruito in casa che è in grado di determinare la posizione 3D degli emettitori fluorescenti mediante l’imaging con la funzione di diffusione del punto a doppia elica (DHPSF)^21,22. Le immagini a singola molecola grezze vengono elaborate utilizzando un software scritto su misura per estrarre le localizzazioni 3D a singola molecola, che vengono poi combinate in traiettorie a singola molecola. Migliaia di traiettorie sono raggruppate per generare distribuzioni di coefficienti di diffusione apparente. In una fase finale, le distribuzioni sperimentali sono in sintonia con distribuzioni generate numericamente ottenute attraverso simulazioni Monte-Carlo di moto browniano in un volume limitato. Applichiamo questo protocollo per risolvere gli stati diffusidella proteina YscQ del sistema di secrezione di tipo 3 nella Yersinia enterocoliticavivente. A causa della sua natura modulare, il nostro protocollo è generalmente applicabile a qualsiasi tipo di esperimento di tracciamento a singola molecola o a particella singola in geometrie cellulari arbitrarie.