生理学的免疫原性樹状細胞を生成するための新規プロトコル

ここに記載されているすべてのマウスの方法は、動物医療のガイドラインの国立研究所と一致して、エール大学の機関の動物のケアと使用委員会 (IACUC) によって承認を受けています。すべての人間の研究は、書面による同意を得て、健康なボランティアが寄付した血液で行われました。人間の血液研究は、認識された倫理的ガイドライン (例えば、ヘルシンキ宣言、CIOMS、ベルモント報告、米国の共通規則) に従って実施され、そして、議定書番号0301023636の下でエール人間治験審査委員会によって承認を受けました。 注:以下は、マウスの同系腫瘍の抗腫瘍治療のための transimmunization を説明するプロトコルである。 1. 同系 YUMM 1.7 腫瘍移植 対象の腫瘍細胞株に適切なようにマウスの側面に同系腫瘍を移植するために確立されたプロトコルに従ってください。注:以下のプロトコルは、YUMM 1.7 C57BL/6 マウスメラノーマ腫瘍モデルを記載している。YUMM 1.7 黒色腫細胞は、エールボーゼンベルク博士によって親切に提供された。 凍結したアリコートの細胞を解凍し、1つの細胞継代の後に細胞を使用します。ダルベッコ改変の修飾ワシの栄養混合物 YUMM 中1.7 細胞 (DMEM/F12)、10% の熱不活性化ウシ胎児血清 (FBS)、1% のペニシリン/ストレプトマイシン、および 1% の非必須アミノ酸を補充し、標準組織培養条件 (37 ° c, 5%co2)。 細胞培養プレートまたはフラスコの底部を覆うのに十分なトリプシン− EDTA を加えることによって 60 \ u201270% コンフルエントで YUMM 1.7 細胞を収集する (例えば、T75 フラスコの場合は 4 mL)。 細胞培養容器を室温で 3 \ u20124 分間安静にし、容器の底部または側面をそっと軽くたたいて、細胞を切り離すのを助ける。 ほとんどの細胞が取り外されると、4 mL のトリプシン-ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA) に 1 mL のウシ胎児血清 (FBS) を加えて、反応を停止させる。15 mL の円錐形の管にピペットで入れることによって細胞を集めなさい。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でフラスコをすすぎ、同じ回収管にリンスを加えます。PBS でチューブを 15 mL に充填します。 小さなアリコートを取り出して細胞を数える。 腫瘍細胞を収集するために、標準的な組織培養遠心分離機で 250 x gで10分間スピンダウンします。 再懸濁 YUMM 1.7 細胞を 1 x 106 細胞/ml の密度で PBS に 100μ l の PBS 中の 1 x 105 yumm 1.7 腫瘍細胞を、レシピエント4〜6週齢の野生型雄 C57BL/6j マウスの右側面に注入し、制度的ガイドラインに従って麻酔をかけた (例えば、3 \ u20125% イソフルラン吸入ガス、麻酔後肢ピンチ反射の欠如により確認された)。 キャリパーを使用して、垂直腫瘍の直径と高さの隔週測定で腫瘍体積を監視します。YUMM 1.7 (腫瘍の長さ x 幅 x 高さ)/2 を計算します。 腫瘍がちょうど触診可能になるとき transimmunization 療法を開始しなさい;YUMM 1.7 腫瘍の場合、これは通常日 7 \ u201210 ポスト腫瘍移植である。 2. Transimmunization 用末梢血単核細胞の収集 頬の血を介して各腫瘍を持つマウスから 100 \ u2012150 μ l の血液を収集します。 血液が収集されているので、5000 U/mL ヘパリンを含む単一の 15 mL チューブ中の各マウス処置群 (各5つの実験マウス + 5 コントロールマウス) から血液をプールする。回収した100μ l あたり 10% ヘパリンの10μ l を使用してください。注:血液凝固を避けるために、収集中に頻繁にチューブを混ぜる.腫瘍担持するマウスの制御は実験マウスと同時に採血することができるが、治療群と同等の条件を確実にするために、「コントロール」血液は、廃棄することができるか、または治療群の血液と結合して、追加の治療群についての実験 PBMC を、研究者の裁量で。 採血された 5 \ u201210 マウスにつき 4 mL のリンパ球分離培地 (材料の表を参照) を用いて 1 15 mL チューブをセットアップした。血液 (腫瘍を担持するマウスから採取した) を培地の上にゆっくりと層した。1000 \ u20121 で20分間、赤血球から PBMC を分離するために 500 x gでスピンする。 遠心分離の終了時に、上部の血漿層を収集し、軟膜の上方に残った〜0.5 の mL を残し、そして後で使用するために 4 °C で保存する (ステップ 7.1)。 軟膜 15 mL チューブにバフィーコート層を収集し、PBS で 15 mL を充填し、PBMC を収集するために標準的な組織培養遠心分離機で 250 x gで10分間スピンする。 慎重に上清を pipet、チューブをフリックしてペレットを再懸濁。ペレットは柔らかく、失われる可能性があるため、デカントしないでください。PBMC から残りの赤血球を除去するために、2 mL の ACK 赤血球溶解バッファー (材料の表を参照) をチューブに加えます。氷上で10分間インキュベートします。 15 mL に PBS でチューブを充填し、PBMC を収集するために、標準的な組織培養遠心分離機で 250 x gで10分間スピンダウン。 慎重に上清を pipet、フリックでペレットを再懸濁。ペレットは柔らかく、失われる可能性があるため、デカントしないでください。注:この段階で、精製された PBMC は、実験に最も適するように修飾することができる。種々の PBMC 成分 (血小板、単球、他の免疫細胞型) は、必要に応じて PBMC から枯渇または単離されることができる。また、PBMC 自体は、セクション4の前または後 (プレート継代の前後—セクション2またはセクション5の前) に、プロトコルステップ 3.3 \ u 20123.8 に従って yumm 1.7 細胞に PBMC を置換することによって、8モップ A に曝露することができる。これは、治療の免疫原性能力を切り捨てる, 代わりに免疫寛容を促進します。. 各治療群 (各5つの実験マウス + 5 コントロールマウス) について、PBMC ペレットを300μ l FBS で再懸濁。 3. 8-腫瘍細胞のモップ/UVA 治療 培養し、YUMM 1.7 腫瘍細胞を収集し、ステップ1.2 〜1.3 に記載されているように、8モップA露出腫瘍細胞抗原源を調製する。 5匹のマウスの治療群あたり 2.5 x 106 yumm 1.7 の腫瘍細胞を調製する。各処置群について、再懸濁は、2.5 x 106 細胞/300 μ l で腫瘍細胞ペレットを FBS 中で (〜 8.33 x 106 細胞/ml) に投与する。 組織培養フードが消灯した後、100 ng/mL の最終8モップ濃度のための YUMM 1.7 腫瘍細胞懸濁液に8モップ (材料のテーブルを参照) を追加します。注意: 8-モップは photoactivatable DNA 損傷剤と発癌物質です。取り扱いと塗布の際は注意し、露出した皮膚との接触を避け、適切に廃棄してください。 細胞をよく混ぜ合わせ、細胞容器を錫箔で包み、20分間 37 °C でインキュベートします。 12ウェル組織培養プレートを、5匹のマウスのすべての治療群 (2.5 x 106 yumm 1.7 腫瘍細胞)に 1 ML の FBS で充填し、4 °C で20分間冷蔵する。 UVA 光源をオンにして温めます。注意:UVA 光は発癌性物質である。UVA 光源で作業する場合は、迅速かつ慎重に作業し、露出から肌を保護し、顔や目を保護するために、顔の盾やゴーグルを使用しています。 20分後、冷蔵12ウェルプレート (ステップ 3.5) を組織培養フードに移動させ、ウェルから FBS を除去し、300μ l (2.5 x 106 細胞/ウェル) のモップ露出した腫瘍細胞 (ステップ3.4 から) を1ウェルあたり加える。 細胞含有プレートを、4 J/cm2 の全照射用に予加温された UVA 光源に晒す。注:ここに記載されている8モップ濃度と UVA 量は、YUMM 1.7 腫瘍細胞株について較正している。8-モップ/UVA 用量の滴定を、曝露の1週間以内に 100% の腫瘍細胞死を引き起こすのに十分な、効果的な殺傷用量を決定するために、各実験腫瘍細胞株について実施すべきである。これは、インビボでマウスの TI 実験にとって極めて重要であり、細胞は宛 orbitally (ステップ 6.1) であり、したがって損傷を受けていない腫瘍細胞は、治療された動物において眼腫瘍を形成し得る。ガイドラインとして, UVA の 4 \ u20128 J/cm2, 100 \ u2012200 Ng/mL 8-モップ, ほとんどの腫瘍細胞株のための典型的な有効範囲である. 各ウェルから8モップの A処理腫瘍細胞を収集し、プレートを旋回させると慎重にピペットで通して、完全な細胞回復を保証します。 4. TI プレートの継代細胞 5匹のマウスの各処置群について、適切な PBMC の1つの 1.5 mL 円錐管300μ l (ステップ2.11 から) および300μ l の 8-モップA処理腫瘍細胞 (ステップ3.9 から) を結合する。細胞を混ぜる。 10 mL シリンジを使用して、TI チューブの「入口」および「出口」セットを充填します (資料表)FBS 付き。チューブクランプを開いてチューブを充填し、シリンジを取り外す前にチューブが充填されたらクランプを閉じ、チューブ内部に FBS を保持します。 P1000 ピペットを使用して、PBMC および腫瘍細胞混合物 (ステップ4.1 から) を TI プレートに添加する (材料の表を参照)。45°の角度でプレートを保持し、ピペットチップを TI プレートの吸気口にしっかりと置き、プレートをゆっくりと充填して泡を避けます。 ピペットプランジャーを放す前に、ピペットチップを吸気口から取り外します。版は450μ l を握る;残りのセルを 1.5 mL の円錐形のチューブに戻します。 FBS 充填チューブ、セル充填 TI プレート、および 37 °C の組織培養インキュベーター内の残りの細胞を含む 1.5 mL の円錐管を1時間インキュベートします。インキュベーション後、TI チューブを重力によって空にし、クランプを解放します。 P1000 ピペットを使用して、プランジャーをプレートポートに押し下げた状態でピペットチップを挿入して、TI プレートからセルを取り外します。45°の角度でプレートを保持し、P1000 ピペットチップを充填します。セルを元の 1.5 mL の円錐形のチューブに戻します。 TI プレートを実行するには、出口チューブをプレートに接続し、TI プレートをプレート走行システムに固定します。 1ml のシリンジを使用して、600μ l の PBMC と腫瘍細胞混合物を 1.5 mL の円錐形のチューブから引き、シリンジ内の任意の気泡を取り除き、クランプを開いて入口チューブにシリンジを取り付け、流体がチューブの端に達するまでゆっくりと充填する。 入口管の自由端を TI 板に取り付け、残りの容積をやさしく装填し続けます。入口クランプを閉めます。 1 mL シリンジを取り外し、入口チューブをシリンジポンプに接続します。細胞のコレクションのためのきれいな 1.5 mL の円錐形の管に出口の管をしっかり固定しなさい。 シリンジ・ポンプの流量を 0.09 mL/min に調整しますが、ポンプはまだ始動しません。TI プレート〜 30°をシリンジ・ポンプ側に向けて傾け、ti プレート実行プラットフォームまたは任意の他の手段 (例えば、プレートの一端の下にある小さな平らな物体) を使用する。 注意深く入口の管のクランプを放しなさい。シリンジ・ポンプを始動し、TI プレートがどのように充満しているか注意深く観察し、必要に応じてチューブまたはプレートをフリックして、気泡が流れを妨げるようにしてください。 TI プレートが完全に充填されると、それが空になると反対方向に ~ 30°傾斜します。すべての細胞および液体が 1.5 mL の円錐形のコレクションの管にあるとき、ポンプを停止しなさい。 TI プレートを洗浄するには、シリンジ・ポンプから入口チューブを外し、600μ l FBS を充填した1ml のシリンジに接続し、手順 4.8 \ u 20124.9 の手順に従ってください。 シリンジ・ポンプの流量を 0.49 mL/min に調整し、入口クランプを放し、ステップ 4.12 \ u 20124.13 で説明されているように TI プレートを実行し、同じ 1.5 mL 円錐形チューブで洗浄を収集します。すべての接着細胞をデタッチして溶出するのを助けるために、TI プレートをゆっくりと全体をフリックまたはタップします。 8分間のベンチトップ microfuge でのコレクション 1.5 mL の円錐形の管を 250 x gで回しなさい。上清を捨てる。 5. 一晩培養培地用自家マウス血清の調製 10 \ u201212 週齢の C57BL/6J マウスから血液を採取し、任意の制度的承認方法 (例えば、眼の出血、尾静脈の出血、頬の出血、または心臓穿刺による末端出血) で、抗凝固剤なし。必要な血清の300μ l ごとの1つの mL の血を集めると見積もってください。注:一つは、実験において5匹のマウスのすべての治療群に対して300μ l の血清を必要とするであろう。 血液を4° c で一晩凝固させます。 凝固した血液を 3000 x gで15分間回転させる。上部の血清含有層を慎重に収集する注:血清は、一晩細胞インキュベーション培地 (ステップ 6.1) を作るためにすぐに使用することができ、または将来の実験のために保存される。血清を保持するために、-20 ° c でアリコートで凍結する。 6. 抗原との PBMC の一晩共インキュベーション 再懸濁は、PBMC および腫瘍細胞ペレット (ステップ 4.5) を、15% の自家マウス血清を有する 2 mL の透明 RPMI (ステップ5で調製した) で処理する。プレートを 35 mm 非組織培養処理した滅菌ディッシュに、標準組織培養条件下で一晩インキュベートした (37 ° c、5% co2)。注:PBMC が非細胞性抗原 (ペプチド、ナノ粒子、タンパク質など) で使用されている場合は、プロトコルのセクション3を省略し、セクション2から直接セクション4に進み、TI プレート通過 PBMC に所望の抗原を追加し、ここで一晩共インキュベーションする。ステップ 6.1. 翌日、皿の底から付着した細胞をティッシュカルチャースクレーパーで慎重に切り離し、細胞の採取を確実にするために掻き取りながら皿を回転させる。15 mL のチューブ内の細胞を収集します。. 2 mL の PBS をディッシュに追加し、同じチューブに細胞を収集し、削り取り工程を繰り返します。35 mm ディッシュを 1 mL PBS でリンスし、リンスを同じチューブに追加します。 細胞を収集するために、標準的な組織培養遠心分離機で 250 x gで10分間スピンします。慎重に上清を pipet し、チューブをフリックしてペレットを再懸濁。ペレットは柔らかく、失われる可能性があるため、デカントしないでください。 7. TI 処理細胞を腫瘍担持するマウスに再注入する 自家血漿のスピンダウン (ステップ2.4 で調製) で15分間 750 x gで微粒子を沈殿させる。再懸濁は、自己血漿または PBS の600μ l 中の細胞ペレット (ステップ6.4 から) を培養する。 適切に麻酔をかけた u20125 のレトロ軌道叢にマウス当たり100μ l の細胞を注入する (例えば、3 \ 1% イソフルラン吸入ガス、後肢のピンチ反射の欠如により麻酔が確認された) 腫瘍を有する実験マウス。所望であれば、自己血漿単独、又は PBS の100μ l の制御腫瘍担持するマウスを再注入する。 YUMM 1.7 腫瘍担持するマウスについては、治療 (ステップ 2-7.2) を週2回、3週間、合計6つの治療について繰り返す。月曜日と木曜日に腫瘍を有するマウスを毎週 (プロトコルセクション 2 \ u20124) から PBMC を収集して処理し、火曜日と金曜日にオーバーナイトインキュベーション (プロトコルセクション 5 \ u20127) 後に再注入する。注:この治療レジメンは、マウスにおける YUMM 1.7 腫瘍の特異的な増殖動態について開発された。より遅いまたはより速い腫瘍増殖率を有する他の腫瘍系に対して滴定する必要があるかもしれない-それぞれの治療回数を増加または減少させる。 隔週の測定によって腫瘍の容積を監察しなさい— (火曜日および金曜日) 療法管理の時には、ノギスを使用して縦の腫瘍の直径そして高さの。制御腫瘍の容積が機関の指針および議定書によって許可される最大サイズに達するとき実験を終了しなさい。 8. ヒト血液の Ssmall 量を治療するためのプロトコールの適応 ヒトの血液から PBMC を最初に単離することによって、人間の細胞で使用するためのプロトコルを適応させる。抗凝固剤としてヘパリンを使用し、任意の好ましい PBMC 分離プロトコールを有する。 最良のプロトコル結果のために、単離された PBMC のフラクションが生理的な血小板数を含んでいることを確認してください。血小板数を監視する任意の標準的な血液学のカウンターを使用して前および後 PBMC の分離。 ヒト細胞性抗原源を使用する場合、YUMM 1.7 細胞についてセクション3に記載の手順に従ってヒト抗原細胞を治療する。滴定 8-それに応じてモップと UVA 用量. セクション4で説明したプレート通過ステップを実行し、TI プレートあたり最大 3 x 107の PBMC を使用します。 培養は、選択した細胞/他の抗原を用いて一晩中、セクション6に記載されているように、ステップ6.1 において一晩培養培地用の自家マウス血漿に対して 15% のヒト AB 血清を代用する。 得られた細胞を任意のアッセイで使用する。例えば、抗原反応性 T 細胞との共培養は、TI 処理細胞によって開始された抗原特異的 T 細胞応答を観察する。