在这里, 我们提出了一个协议, 使用噻唑橙检测 DNA 的凝胶电泳实验。使用噻唑橙可以消除溴化乙酯, 并且可以使用紫外或蓝光进行荧光检测。
Abstract
使用琼脂糖进行 DNA 凝胶电泳是分子生物学实验室中常见的工具, 可以按大小分离 DNA 片段。分离后, DNA 通过染色进行可视化。这篇文章演示如何使用噻唑橙染色 DNA。与普通染色方法相比, 噻唑橙与普通染色方法相比是有利的, 因为它敏感、价格低廉、可与紫外线或蓝光激发 (以防止样品损坏), 并且比溴化乙酯更安全。已经配备了使用溴化乙酯进行 DNA 电泳实验的实验室通常可以在不对现有协议作额外修改的情况下切换染料, 使用紫外线进行检测。蓝光检测, 以避免样品损坏, 还可以实现与蓝光源和发射过滤器。已经配备了蓝光检测设备的实验室可以简单地切换染料, 而无需对现有协议进行其他更改。
TO 并不是溴化乙酯的唯一荧光染料替代品;它的优势在于成本。to 在20世纪80年代被发现为网状细胞染色8, 并已在一些基于 dna 的荧光实验9,10,11, 12,13中发现了有用的。它目前由多个供应商出售。TO 是额外的、更昂贵的蓝光–可检测到的商业染料的父化合物, 在电泳过程中表现类似, 使用紫外线或蓝光进行检测1。此外, 虽然其他染料对 Dna 浓度比 EtBr 或 TO 更敏感, 但对于一般电泳实验, 此类染料在许多情况下的成本高得令人望而却步。
Protocol
1. 准备凝胶 注: 关于一般的凝胶电泳协议, 另见 p. y. lee 等。14岁 混合琼脂糖 (~ 1% wv, 特定大小分离的百分比可以变化) 在缓冲液 (约70毫升的小凝胶 (8 x 7 厘米))。缓冲器通常是 TAE (三-醋酸-edta, 40 mM Tris, 20 mm 醋酸, 1 mM EDTA, pH 值约 8.6) 或 TBE (三硼酸盐 edta, 90 mM Tis, 90 mm 硼酸盐, 2 mM EDTA, pH 值约 8.3)。 将噻唑橙添加到1.3μgml 的最终浓度。 <li…
Representative Results
噻唑橙可以检测 DNA, 无需使用溴化乙酯, 也无需使用 dna 有害的紫外线。溴化乙酯是众所周知的诱变性, 因此从实验室中消除它可能是有利的。紫外线会显著损害 DNA 并降低转化效率, 而蓝光不会对 DNA 造成损害。溴化乙酯、噻唑橙和一种普通的蓝光–可检测的商业 DNA 染料 (图 1, 见材料表) 之间的检测限值相似, 所有三种染料的检测限值均为微型凝胶中的 ~ 1-2 ng/lane<…
Discussion
尽管已知毒性, 但溴化乙酯长期以来一直是分子生物学实验室的标准工具。它还受到需要紫外线的影响, 紫外线会在检测到 DNA 时对其造成损害。噻唑橙提供了一种廉价的替代溴化乙酯, 以及有用但昂贵的商业染料。
O’Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes. J. Vis. Exp. (145), e59341, doi:10.3791/59341 (2019).