JoVE Journal > Bioengineering
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工学

Оценки распространения кератиноцитов на двух - и трехмерных типа коллаген субстратов

Published: April 22, 2019
doi:
10.3791/59339
, , ,
1Nippi Research Institute of Biomatrix, 2解剖・細胞生物学科,Osaka Medical College

概要

Здесь мы представляем протокол для подготовки двух различных форм культуры субстратов использования типа коллагена. В зависимости от того, как обрабатывается коллагена молекул коллагена поддерживать двухмерный, неволокнистые формы или соберите в трехмерном, волосики форму. Пролиферация клеток на типа коллаген резко пострадавших от формирования волосики.

Abstract

Тип I коллаген, полезные как субстрат для клеточной культуры, существует в двух формах: двухмерный, неволокнистые формы и объемно, волосики. Обе формы может быть подготовлен с той же типа коллагена. В общем неволокнистые форма способствует клеточной адгезии и распространения. Волосики форма (гели) обеспечивает более физиологических условиях во многих типах клеток; Таким образом культура гель является полезным для изучения физиологических поведение клеток, таких как эффективность препарата.

Исследователи могут выбрать подходящую форму согласно цели его использования. Например в случае кератиноцитов, использовалась на гель культуры как ранозаживляющее модель. FEPE1L-8, линии клеток кератиноцитов культивированный неволокнистые форму типа я коллагена, способствуют клеточной адгезии. В частности кератиноцитов распространение в форме фибриллярных медленнее неволокнистые формы. Протоколы для подготовки я коллагена для тип культуры клеток просты и имеют широкое применение в зависимости от потребностей в экспериментальной.

Introduction

Интерстициальный соединительной ткани составляют трехмерной белка сеть разнородных композиции, в основном состоят из типа я фибрилл коллагена1. Фибрилл коллагена играют ключевую роль в качестве лески для клетки1,2,3 и взаимодействовать с другими белков внеклеточного матрикса (ECM)3. В пробирке, различные формы типа коллаген может использоваться как субстраты для культуры клеток в зависимости от обработки метода1,2,3,4. В кислых условиях, тип I коллаген поддерживает неволокнистые форма5. Покрытие поверхности культуры блюд с неволокнистые форма способствует ячейки адгезии и распространения6,7. В физиологических рН и температуры, типа молекул коллагена собрать в фибрилл, которые формируют гели, обладая трехмерной структуры1,2,3,4, 56,,,78. Существует несколько важных различий между волосики и неволокнистые форм типа я коллагена, включая матрицы жесткости и эффективность восстановления компонентов ECM клеток во время культуры1. Матрицы жесткости является одним из наиболее изученных регулирования факторов культуры клеток в1, 9. Однако сложных взаимодействий между субстратов и клетки еще предстоит уточнить. Для изучения сложного взаимодействия между клетками и экологические факторы, простая система является полезным. Сравнение клеточного поведения на двух различных форм коллагена может помочь упростить влияние экологических факторов. В зависимости от цели их использования, различные формы типа я коллагена может использоваться выборочно. Как правило кератиноциты находятся в контакте с базальной мембраны, но не с типа я коллагена. Однако во время заживления ран, кератиноциты переместить в кожных соединительной ткани, размножаться и залечить раны10.

Недавно, мы показали, что концентрации внеклеточного кальция имеет важное значение для распространения кератиноцитов линии клетки с помощью системы культуры на форме фибриллярных типа коллагена, имитируя кожный соединительной ткани11. Когда линии клеток кератиноцитов, FEPE1L-8 был культивированный на форме фибриллярных типа я коллагена, форма клеток была круглой и их разрастания были остановлены на концентрации внеклеточного кальция 30 мкм11. Когда концентрация кальция было увеличено до 1,8 мм, клеточный рост был восстановленные11. Клетки рос под обе концентрации кальция (30 мкм и 1,8 мм) при культивированный неволокнистые форму11, в то время как они были более чувствительны к концентрации экзогенных кальция при культивировали в форме волосики. FEPE1L-8 был создан через трансфекции с вирусом папилломы тип 16 преобразование генов E6 и E7 от человека рак шейки матки, опухолеобразования, подавляют неограниченное распространение с ограниченным дифференциация потенциал как нормальные кератиноцитов 12,13. FEPE1L-8 клеток может поддерживаться с помощью некоторых видов конкретных средний кератиноцитов, включая K110 тип-II с добавкой дополнение K-1 (K110)6. Здесь мы описываем протокол культуры человека кератиноцитов клеточной линии на неволокнистые и фибриллярных форм типа коллагена.

Protocol

1. Подготовка носителя культуры кератиноцитов Примечание: Выполните все процедуры в асептических условиях. Добавьте 5 мл пенициллина и стрептомицина и 10 мл Добавка дополнение K-1 до 500 мл среды K110 типа-II (K110) с помощью пипетки. 2. Подготовка фибриллярных формы типа коллагена Примечание: Выполните процедуры до шага 2.6 в асептических условиях. Держите 10 x фосфат амортизированное saline (PBS (-)), деионизированной воды, коллаген, плиту 96-луночных культуры и пустой 2-мл на льду.Примечание: Не используйте пластину же подготовить волосики и неволокнистые форм. Добавьте 1.12 мл деионизованной воды пустой 2-мл пробирку с помощью пипетки. Добавьте 200 мкл 10 x PBS (-) для обессоленной воды в 2-мл пробирку с помощью пипетки. Осторожно встряхните трубки несколько раз. Добавьте 0,66 мл коллагена в 2-мл пробирку с помощью пипетки. Аккуратно и быстро несколько раз взболтайте трубки.Примечание: Во избежание формирования пузыря в решении как можно больше. Готовят непосредственно перед использованием коллагена раствор. Залейте 100 мкл раствора коллагена от шага 2.3 в каждой скважине пластину 96-луночных культуры. Осторожно встряхните пластину культуры в левом правом движения.Примечание: Покрывают всю поверхность скважин с коллагена раствор. Если решение не покрывает всю поверхность, распространение решения с помощью кончика пипетки. Избегайте образования пузыря в решении как можно больше. Место культуры пластины в инкубатор CO2 и Инкубируйте на 37 ° C в течение 1 ч. проверить гелеобразования коллагена и двигаться пластину культуры к чистой скамейке.Примечание: Подтвердите гелеобразования, отогнув пластину культуры. Осторожно наливайте 150 мкл K110 на гелях, с помощью пипетки вдоль стены колодца, место культуры пластины в инкубатор CO2 и Инкубируйте на 37 ° C в течение 1 ч. двигаться пластину культуры к чистой скамейке. До клеточной культуры, аккуратно удалить K110 с помощью пипетки.Примечание: Чтобы защитить гели, кончиком пипетки должны касаться стены колодца. 3. Подготовка неволокнистые формы типа коллагена Примечание: Выполните все процедуры в асептических условиях. 4 мкл коллагена до 1,2 мл 1 мм соляной кислоты (HCl) в 1,5 мл тюбик и осторожно перемешать с помощью пипетки.Примечание: Готовят непосредственно перед использованием коллагена. Держите коллагена и HCl, охлажденной до момента использования. Залейте 100 мкл коллагена в каждой скважине 96-луночных культуры пластины с помощью пипетки. Осторожно встряхните пластину культуры в слева направо движения и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч.Примечание: Убедитесь, что вся поверхность лунки покрыта решения. После инкубации отменить решение коллаген и Промыть лунки с PBS (-) дважды с помощью пипетки. Залить 150 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина/PBS (-) (1% BSA) хорошо пластины 96-луночных культуры и инкубации при комнатной температуре за 1 ч до культуры клеток, выбросьте BSA 1%.Примечание: Убедитесь, что вся поверхность лунки покрыта решения. 4. Культура клеток FEPE1L-8 Примечание: Выполните все процедуры в асептических условиях. Сохранить FEPE1L-8 клеток в K110 в 100 мм культуры блюдо в инкубатор CO2 и инкубировали при 37 ° C и 5% CO2, на полу confluency. Подготовить K110, трипсина и ингибитор трипсина в водяной бане при температуре 37 ° C. Тщательно удалить носитель из культуры блюдо, добавить 3 мл 0,05% трипсина, с помощью пипетки, поместите блюдо в инкубатор CO2 и инкубировать при 37 ° C за 5 мин. После инкубации Проверьте ячейки отряда от поверхности культуры блюдо с помощью фазово контрастной микроскопии при 10-кратном.Примечание: Морфология отдельностоящий клеток становится раунда. Если клетки, Инкубируйте на дополнительный период, 5 мин. Добавить 3 мл ингибитора трипсина и собирать отдельные ячейки в 15 мл пластиковых пробирок с помощью пипетки. Центрифуга для ячеек в 15 мл пластиковых пробирок на 200 x g за 5 мин. Отменить супернатант и вновь приостановить гранулы в 10 мл K110 с помощью пипетки. Подсчитать ячейки, используя фазово контрастной микроскопии при 10-кратном и подготовить концентрации клеток на 5,0 x 10-4 клеток/мл соответствующих разрежения с K110. Аккуратно семян 0,1 мл K110 с ячейками в каждой скважине культуры пластины с помощью пипетки вдоль стены колодца. Место пластину культуры в CO2 инкубатора и инкубации при 37 ° C для указанного времени (2 часа, 1 день, 3 дня).Примечание: Чтобы защитить гели, кончиком пипетки должны касаться стены колодца. 5. Оценка количество жизнеспособных клеток Инкубировать K110 в водяной бане при температуре 37 ° C. Mix 130 мкл tetrazolium соли, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, мононатрия соли (WST-8) и 1,3 мл K110 в 2-мл пробирку с помощью пипетки. Двигаться пластину культуры на лавочке чистой и аккуратно Выбросьте K110 с помощью пипетки. Аккуратно смыть non сторонник клетки с K110 с помощью пипетки Добавить что 110 мкл K110 смешанного с WST-8 в каждой хорошо с помощью пипетки, место пластину культуры в CO2 инкубатора и инкубировать при 37 ° C на 2 ч. Переместить пластину культуры к чистой скамейке, собирать 100 мкл кондиционером среды от каждой скважины и переместить его в скважину другой культуры 96-луночных пластины. Измерять поглощение на длине волны 450 Нм (450OD) с помощью Считыватель микропланшетов и оценкам количество жизнеспособных клеток.

Representative Results

Схематическое представление обработки поверхностей культуры блюд с использованием типа коллаген изображен на рисунке 1. Морфологии клеток наблюдается на неволокнистые и фибриллярных формы представлены в левой и правой стороне панели Рисунок 2, соответственно. FEPE1L-8 клеток были культивированный 2 h (верхняя панели) и 3 дня (нижняя панели). В первоначальных 2 ч культивирования клетки придерживался и выкладывают на обеих форм коллагена (рис. 2, верхней панели). Через три дня после посева, клетки неволокнистые форме продолжали распространять и клеточной число возросло (рис. 2, нижней левой панели). В отличие от клеток в форме фибриллярных показал, ограниченного распространения (рис. 2, нижней правой панели). FEPE1L-8 клетки продолжают размножаться неволокнистые форму типа коллагена (рис. 3, сплошная черная линия, закрытые черные круги) и на блюдо необработанной поверхности (рис. 3, пунктирной серой линии, закрытые серые круги). В отличие от клеток не увеличивается число фибриллярных формы (рис. 3, пунктирная линия, кружков). Фудзисаки et al11были изменены Рисунок 2 и на рисунке 3 . Рисунок 1 : Схематические представления культуры блюдо поверхностей обращаться с типом коллаген. В кислых условиях тип I коллагена, который адсорбированных молекул на поверхности блюдо в форме неволокнистые (левая панель). В нейтральных условиях при 37 ° C тип I коллагена молекулы собрал в фибриллами и адсорбироваться на поверхности блюд в форме геля (правая панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 : Морфология клеток FEPE1L-8. FEPE1L-8 клеток в K110 были культивируемых с помощью неволокнистые формы (10 мкг/мл; левой панели) или фибриллярных форме (1 мг/мл; правой панели) тип I коллагена для 2 h (верхняя панели) или 3 дней (нижняя панели). Белые бары показывают 100 µm. Рисунок 2 был изменен из Фудзисаки et al. в Рисунок 1E – H11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 : Распространение клеток FEPE1L-8. Количество жизнеспособных клеток оценивались на неволокнистые форме (черная сплошная линия, черные круги, заполненные) или на волосики формы (пунктирная линия, открытые круг) тип I коллагена, или необработанной блюдо поверхности (серый пунктирная линия, серые круги заполнены) за 2 ч, 1 день и 3 дня. Эксперименты были проведены в triplicates и значения отображаются как средства + ур. Эта цифра была изменена от Фудзисаки et al. в Рисунок 1J11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Некоторые компоненты ECM, включая тип I коллаген, формы трехмерных структур в естественных условиях1. Культивирование на такой трехмерный, субстрат гель обеспечивает более физиологических условиях в vitro чем на двухмерный, пластиковые поверхности1,2,3,4. Поступили многочисленные протоколы относительно метода культуры гель, например с помощью типа коллагена1,2,3,4,6,7, 11, тип IV коллаген14,15и16Matrigel. Тип I Коллаген является четко определенной и широко используется материал из-за его изобилия и простотой в обращении. Особенности очищенный типа я коллагена зависит от животных видов, возраст и очистки методы5,17. Тип I коллагена могут быть очищены с помощью уксусной кислоты или протеаз, например пепсин, папаин и proctase5,17. Кислотно растворимых коллагена утверждает, что амино telopeptides и протеаз растворимый коллаген, рассеченного амино telopeptides5,17. Защищены длина амино telopeptides зависит от типа протеаз, и присутствие telopeptides влияет на морфологию волосики и гель прочности5,17. Вязкость фибрилл коллагена кислотно растворимых больше, чем лечить протеазы коллагены17. В этом исследовании, мы использовали кислотно растворимых бычьего типа коллагена. Коллаген, пепсин солюбилизирован может также использоваться в настоящем Протоколе гель культуры; Однако прочность геля-слабее17. Эти различия в материалах может вызвать поведенческие различия клетки, но они в настоящее время не вполне понятны.

Протокол культуры гель, описанный в настоящем исследовании является очень простой. Было зарегистрировано много модификаций этого метода. Один из возможных изменений для культуры кератиноцитов заключается в том, чтобы имитировать базальной мембраны. Тип IV коллагеновые гели могут быть лучше сохранить структуру базальной мембраны как субстрат в vitro15,18. Однако длительный инкубационный период необходим для подготовки типа IV коллагеновые гели14,15,18. Вместо этого, смешивания коллаген типа IV, с I типа коллагеновые гели могут производить Роман культуры субстратов (тип I / тип IV коллагена гибридные гели)19. Эти гибридные гели легко обрабатывать, требуется некоторое время для гелеобразования и принести больше базальной мембраны как условия для кератиноцитов. На тип I / тип IV коллагена гибридные гели, кератиноциты выжить, формируют колонии и побудить терминала дифференциация19. Этот метод гибрид имеет универсальность применения.

Культура-гель с использованием типа коллаген влияет на раковые клетки. На форме фибриллярных типа коллаген, Akt активации и рост клеток Caco-2 (линия клетки рака толстой кишки), подавленные7. Кроме того рост человека меланомы клеток (M24met) в форме фибриллярных арестован на G1/S контрольно-пропускного пункта20. Кроме того заметно повысить уровень реактивнооксигенных видов наблюдаются в мышиных 3T3-L1 preadipocytes культивировали в форме волосики. Кроме того пролиферации и миграции стимулируются в противоположных направлениях неволокнистые и фибриллярных форм типа коллаген21.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны доктор K. Секигучи (Институт исследований белков, Осакский университет), д-р м. Ямада (Институт исследований белков, Осакский университет), д-р T. Ikejima (Китай-Япония исследовательский институт медицинских и фармацевтических наук, колледж Wuya Инновации, Шэньян фармацевтический университет) и т. Хаяси (Китай-Япония исследовательский институт медицинских и фармацевтических наук, колледж Wuya инноваций, Шэньян фармацевтический университет) за полезные замечания.

Materials

Albumin, from bovine serum (BSA) Merck KGaA A4503
1 % BSA  Merck KGaA A4503 Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate 
Cell Counting Kit-8 Dojindo Molecular Technologies, Inc. 347-07621 tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) 
Collagen type I (Acid soluble collgen) Nippi Inc. ASC-1-100-20 from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL
disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate ADVANTEC Co., LTD. 25CS020AS 0.2 µm pore size
human keratinocyte line cell  FEPE1L-8  Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)   
K-1 Kyokuto Seiyaku Inc. 28204 additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin
K110 Type-II medium Kyokuto Seiyaku Inc. 28204 keratinocyte basal culture medium 
K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) Kyokuto Seiyaku Inc. 28204 Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium 
PBS (-)  Merck KGaA P-5368 Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate 
10x PBS (-) Merck KGaA P-5368 Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate 
Penicillin-Streptomycin MP Biomedicals, LLC 1670049 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline
Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 Merck KGaA P-5368-10 pack
Trypsin from porcine pancreas Merck KGaA T4799
0.05 % trypsin  Merck KGaA T4799 Dissolve 0.25 g of  trypsin and  0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-)  and filtrate 
Trypsin inhibitor from soybean FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation 202-20123
Trypsin inhibitor  FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation 202-20123 Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
  2. Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
  3. Kleinman, H. K., Haralsonand, M. A., Hassell, J. R., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. , 289-301 (1995).
  4. Yamato, M., Hayashi, T., Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. , 123-140 (1998).
  5. Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
  6. Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
  7. Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
  8. Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
  9. Shih, Y. -. R., Tseng, K. F., Lai, H. -. Y., Lin, C. -. H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
  10. Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).
  11. Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
  12. Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
  13. Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
  14. Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
  15. Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
  16. Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922 (2014).
  17. Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
  18. Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
  19. Hattori, S., et al. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. , (2015).
  20. Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
  21. Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).

タグ

CollagenType I Collagen2D Culture3D CultureCell CultureKeratinocytesProliferationSubstratePBSHydrochloric AcidCell BehaviorBiological EnvironmentCulture MediumGelationIncubation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Fujisaki, H., Futaki, S., Mizuno, K., Hattori, S. Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates. J. Vis. Exp. (146), e59339, doi:10.3791/59339 (2019).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image