Keratinocyte 확산에 2-및 3 차원의 평가 유형 I 교원 질 기판

1입니다. 준비 keratinocyte 문화 매체의 참고: 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다. 페니실린-스와는 피 펫을 사용 하 여 첨가제 K110 유형-II 매체 (K110)의 500 mL를 보충 K-1의 10 mL 5 mL를 추가 합니다. 2. 준비의 fibril 형태의 유형 I 교원 질 참고: 무 균 조건 하에서 2.6 단계까지 절차를 수행 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS (-)), 이온된 수, 콜라겐, 96 잘 문화 플레이트, 그리고 얼음에 빈 2 mL 튜브 x 10을 유지.참고: fibril 비 섬유 형태를 준비 하는 같은 접시를 사용 하지 마십시오. 피 펫을 사용 하 여 빈 2 mL 튜브에 이온된 수의 1.12 mL를 추가 합니다. 10 x PBS (-)의 200 µ L를 피 펫을 사용 하 여 2 mL 튜브에 이온된 수를 추가 합니다. 부드럽게 튜브 여러 번 흔들어. 피 펫을 사용 하 여 2 mL 튜브에 콜라겐의 0.66 mL를 추가 합니다. 빠르고 부드럽게 흔들어 튜브 여러 번.참고: 가능한 솔루션에 거품 형성을 피하십시오. 즉시 사용 하기 전에 콜라겐 솔루션을 준비 합니다. 96 잘 문화 접시의 각 음에 2.3 단계에서 콜라겐 솔루션의 100 µ L를 붓는 다. 부드럽게 오른쪽 모션을 왼쪽에 문화 접시를 흔들.참고: 콜라겐 솔루션 우물의 전체 표면을 커버. 솔루션 전체 표면을 커버 하지 않는, 피 펫 팁을 사용 하 여 솔루션을 전파. 가능한 솔루션에 거품 형성을 하지 마십시오. 장소 문화와 CO2 인큐베이터에 접시 1 h. 위해 37 ° C에서 품 어 콜라겐 겔 화를 확인 하 고 깨끗 한 벤치에 문화 접시를 이동.참고: 문화 접시를 기울이기로 겔 화를 확인 합니다. 부드럽게 잘, 장소 문화와 CO2 인큐베이터에 접시 1 h. 이동 문화 접시 깨끗 한 벤치를 37 ° C에서 품 어의 벽을 따라 피 펫을 사용 하 여 젤에 K110의 150 µ L를 붓는 다. 세포 배양 전에 부드럽게는 K110 삭제는 피 펫을 사용 하 여.참고:는 젤을 보호 하는 피 펫의 끝 우물의 벽을 터치 한다. 3. 준비의 비 섬유 형태의 유형 I 교원 질 참고: 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다. 1.5 mL 튜브에 1 m m 염 산 (HCl)의 1.2 mL에 콜라겐의 4 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합 한 피 펫을 사용 하 여.참고: 콜라겐 즉시 사용 하기 전에 준비. 콜라겐과 HCl 사용의 시간까지 냉장 하십시오. 피 펫을 사용 하 여 96 잘 문화 판의 각 우물에 콜라겐 100 µ L를 붓으십시오. 부드럽게 1 시간 실 온에서 품 어 모션 마우스 오른쪽 왼쪽에 문화 접시를 흔들.주: 확인 우물의 전체 표면 솔루션으로 덮여 있다. 부 화 후 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고 PBS (-)를 피 펫을 사용 하 여 두 번으로 우물을 씻어. 1% 소 혈 청 알 부 민/PBS (-) (1 %BSA) 96 잘 문화 접시의 우물을의 150 µ L를 부 어 1 헤 셀 문화 이전에 대 한 실 온에서 품 어, 1 %BSA 삭제.주: 확인 우물의 전체 표면 솔루션으로 덮여 있다. 4입니다. FEPE1L-8 세포의 문화 참고: 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다. K110 100 m m에서 FEPE1L-8 셀 문화 공동2 인큐베이터에 접시와 37 ° C, 5% CO2, 반 confluency에서 incubated 유지 합니다. K110, 트립 신, 트립 신 억제제 37 ° c.에 물 욕조에 준비 조심 스럽게 문화 접시에서 매체를 제거, 추가 피 펫을 사용 하 여 0.05 %trypsin 3 mL, CO2 인큐베이터에 접시를 놓고 하 고 5 분 동안 37 ° C에서 품 어. 부 화, 후 10 배 확대에 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 문화 접시의 표면에서 셀 분리를 확인 합니다.참고: 분리 된 세포의 형태는 라운드 됩니다. 만약 셀 확산, 5 분의 추가 기간 동안 품 어. 트립 신 억제 물 3 mL를 추가 하 고는 피 펫을 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브에서 분리 된 세포를 수집 합니다. 5 분 동안 200 x g에서 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 원심 상쾌한 삭제 하 고 다시는 피 펫을 사용 하 여 K110 10 mL에 펠 릿을 일시 중단. 10 배 확대에 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀을 계산 하 고 셀 농도 104 셀/mL x 5.0에 K110와 적절 한 희석에 의해 준비. 부드럽게 셀에 우물의 벽을 따라 피 펫을 사용 하 여 문화 판의 각 잘 K110의 0.1 mL 씨. CO2 배양 기에서 문화 접시를 놓고 지정된 시간 (2 시간, 1 일, 3 일)에 대 한 37 ° C에서 품 어.참고:는 젤을 보호 하는 피 펫의 끝 우물의 벽을 터치 한다. 5. 가능한 셀 수의 추정 K110 37 ° c.에 물 목욕에 품 어 Tetrazolium 소금, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, 글루타민 (서 부 표준시-8), 소금과 피 펫을 사용 하 여 2 mL 튜브에 K110의 1.3 mL의 믹스 130 µ L. 클린 벤치를 문화 접시를 이동 하 고 부드럽게는 K110 삭제는 피 펫을 사용 하 여. 부드럽게 멀리 세척 K110와 비 부착 한 세포를 피 펫을 사용 하 여 K110의 110 µ L 혼합 서 부 표준시-8 잘 사용 하 여 각는 피 펫에 추가, 문화 접시 CO2 배양 기에 놓고 2 h 37 ° C에서 품 어. 깨끗 한 벤치에 문화 접시를 이동, 각 우물에서 조절된 하는 매체의 100 µ L를 수집 하 고 다른 96 잘 문화 격판덮개의 우물으로 이동. 450의 파장에서 흡 광도 측정 nm (OD450) microplate 리더와 예상 가능한 셀 수를 사용 하 여.