Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Hitomi Fujisaki; Sugiko Futaki; Kazunori Mizuno; Shunji Hattori

doi:10.3791/59339

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

生物工学

Keratinosit yayılması üzerine iki ve üç boyutlu değerlendirilmesi tip ı kollajen yüzeylerde

Published: April 22, 2019

doi:

10.3791/59339

Hitomi Fujisaki¹, Sugiko Futaki², Kazunori Mizuno¹, Shunji Hattori¹

¹Nippi Research Institute of Biomatrix, ²解剖・細胞生物学科,Osaka Medical College

概要

Burada, iki farklı türde kültür yüzeylerde hazırlanması için bir iletişim kuralı mevcut kullanan tip ı kollajen. Bağlı olarak kollajen nasıl işlendiğini, kolajen molekülleri iki boyutlu, fibröz olmayan bir form korumak ya da üç boyutlu, Fibriller formuna yeniden birleştirmek. Hücre çoğalması olarak tip ı kollajen fibril oluşumu ile büyük ölçüde etkilenir.

Abstract

Tip ı kollajen, bir substrat hücre kültürü, mevcut olduğundan iki biçimde yararlı: iki boyutlu, lifli form ve üç boyutlu, Fibriller formu. Her iki formu ile aynı hazırlanabilir tip ı kollajen. Genel olarak, lifli form hücre adezyon ve nükleer silahların yayılmasına karşı teşvik etmektedir. Fibriller formu (jeller) hücreleri birçok türde daha fazla fizyolojik şartlarda sağlar; Bu nedenle, jel kültür hücreleri, uyuşturucu etkinliği gibi fizyolojik davranışlarını incelemek için kullanışlıdır.

Araştırmacılar, kullanım amacına göre formu uygun seçebilirsiniz. Örneğin, keratinositler söz konusu olduğunda, jel üzerinde kültür modeli şifa bir yara kullanılmıştır. FEPE1L-8, keratinosit hücre kültürünü kültürlü fibröz form türü üzerinde ben kollajen, hücre adezyon teşvik. Özellikle, keratinosit yayılması daha lifli formu Fibriller formunda yavaştır. Protokolleri hazırlanması için tip ı kollajen hücre kültürü için basit ve deneysel gereksinimlerine bağlı olarak geniş uygulamalar vardır.

Introduction

İnterstisyel bağ dokuları oluşturan üç boyutlu bir protein meshwork heterojen kompozisyon, öncelikle oluşan türü ben kollajen liflerinde¹. Kollajen liflerinde Kök hücreleri¹^,²^,³ için bir iskele olarak önemli bir rol oynar ve diğer hücre dışı Matriks (ECM) proteinler³ile etkileşim. İn vitro, farklı formları tip ı kollajen yüzeyler işleme bağlı olarak hücre kültürü için kullanılabilir yöntem¹^,²^,³^,⁴. Asitli koşullarda, tip ı kollajen fibröz form⁵korur. Kültür yemekleri fibröz formu ile yüzey kaplama hücre adezyon ve nükleer silahların yayılmasına karşı⁶^,⁷teşvik etmektedir. Fizyolojik pH ve sıcaklık, tip ı kollajen moleküllerin üç boyutlu yapısı¹^,²^,³^,⁴^, sahip jelleri oluşturan liflerinde yeniden monte⁵^,⁶^,⁷^,⁸. Orada birkaç önemli farklılıklar Fibriller ve fibröz form türü ben kollajen, matris sertlik ve ECM bileşenleri hücreleri tarafından yeniden inşası sırasında kültür¹verimliliği de dahil olmak üzere. Matris sertlik hücre kültürü¹^, ⁹en çok çalışılan düzenleyici faktörlerden biridir. Ancak, yüzeyler ve hücreler arasındaki karmaşık etkileşimler netleştirilmelidir kalır. Hücreleri ve çevresel faktörler arasındaki karmaşık etkileşimler incelemek için basit bir sistem yararlıdır. Karşılaştırma kollajen iki farklı formlarda hücresel davranışının çevresel faktörler etkisi kolaylaştırmak için yardımcı olabilir. Bunların kullanımı, farklı formları türü bilerek bağlı kollajen seçmeli olarak kullanılabilir. Normalde, keratinositler membran ile temas vardır ama ile değil tip ı kollajen. Ancak, yara iyileşmesi, keratinositler dermal bağ dokusu ile hareket sırasında çoğalırlar ve¹⁰yara iyileşmesi.

Son zamanlarda, biz gösterdi ekstraselüler kalsiyum konsantrasyonu keratinosit yayılması için önemli kültür sistemi üzerinde Fibriller şeklinde kullanarak satır hücreleri tip ı kollajen dermal bag doku¹¹taklit. FEPE1L-8 Fibriller formda kültürlü keratinosit hücre kültürünü yazdığınızda ben kolajen hücrelerinin şekli yuvarlak, onların proliferations bir hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu 30 mikron¹¹durdurmuş. Kalsiyum konsantrasyonu 1.8 mM ye çıkartılmış, hücre büyümesini kurtarılan¹¹oldu. Hücreleri her iki kalsiyum konsantrasyonu (30 mikron ve 1.8 mM) altında büyüdü ne zaman Fibriller formunda kültürlü zaman eksojen kalsiyum konsantrasyonu daha duyarlı olduklarını ise fibröz form¹¹, kültürlü. FEPE1L-8 transfection Papilloma virüsü türü 16 dönüşüm genlerin E6 ile aracılığıyla oluşturulan ve E7 insan servikal Karsinomu, Sigara tumorigenic, üzerinden sınırsız nükleer silahların yayılmasına karşı sınırlı farklılaşma normal lenfositi^{gibi potansiyel ile inhibe 12}^,¹³. FEPE1L-8 hücreleri keratinosit özel ortam, K110 tip-II ile katkı takviyesi K-1 (K110)⁶dahil olmak üzere bazı tür kullanılarak korunabilir. Burada, biz insan keratinosit hücre kültürünü kültür protokolünden sigara-lifli üzerinde tarif ve fibril formları tip ı kollajen.

Protocol

1. keratinosit kültür orta hazırlanması Not: aseptik koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin. 5 mL penisilin-streptomisin ve 10 mL K110 tip-II orta (K110) 500 ml katkı takviyesi K-1 bir pipet kullanarak ekleyin. 2. Fibriller şeklinde hazırlanması tip ı kollajen Not: adım 2.6 aseptik koşullar altında kadar yordamları gerçekleştirin. 10 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS (-)), deiyonize su, kollajen, bir 96-şey kültür plaka ve boş bir 2 mL tüp buz üzerinde tutun.Not: aynı plaka Fibriller ve fibröz olmayan formlar hazırlamak için kullanmayın. 1.12 mL deiyonize su bir pipet kullanarak bir boş 2 mL tüp ekleyin. 10 x PBS (-) 200 µL bir pipet kullanarak 2 mL tüp deiyonize su ekleyin. Yavaşça tüp birkaç kez sallamak. Kollajen 0,66 mL bir pipet kullanarak 2 mL tüp ekleyin. Yavaşça ve hızlı bir şekilde tüp birkaç kez sallamak.Not: kabarcık oluşumu çözüm mümkün olduğunca kaçının. Kollajen çözüm kullanmak için hemen önceden hazırlayın. Adım 2.3 96-şey kültür plaka her kuyuya kollajen çözeltinin 100 µL dökün. Hafifçe sola doğru hareket içinde kültür plaka salla.Not: wells kollajen çözüm ile tüm yüzeyi kapsamaktadır. Çözüm tüm yüzey kapsamaz, pipet ucu kullanarak çözüm yaymak. Kabarcık oluşumu çözüm mümkün olduğunca kaçının. Kültür plaka CO2 kuluçka makinesine koyun ve 1 h. onay jelleşme kollajen için 37 ° C’de kuluçkaya ve kültür plaka temiz bir tezgah için hareket.Not: kültür plaka eğerek jelleşme onaylayın. K110 150 µL kuyu, kültür CO2 kuluçka makinesine plaka ve 1 h. temiz bir Bank kültür plaka taşımak için 37 ° C’de kuluçkaya yer duvar boyunca bir pipet kullanarak jeller üzerinde yavaşça dökün. Önce hücre kültürü, yavaşça K110 atmak bir pipet kullanarak.Not: jelleri korumak için pipet ucu kuyu duvarı dokunmatik gerekir. 3. sigara fibröz şeklinde hazırlanması tip ı kollajen Not: aseptik koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin. 1.2 mL 1 mM hidroklorik asit (HCl) 1,5 mL tüp 4 µL kollajen ekleyin ve karışımı yavaşça bir pipet kullanarak.Not: kollajen hemen kullanmak için önceden hazırlayın. Kollajen ve kullanım zamana kadar soğutulmuş HCl tutun. 100 µL kollajen bir pipet kullanarak bir 96-şey kültür plaka her kuyunun içine dökün. Yavaşça hareket sağ ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya bir sol kültür plaka sallamak.Not: emin olun kuyuları tüm yüzeyine çözüm ile kaplıdır. Kuluçka sonra kollajen çözüm atın ve wells iki kez bir pipet kullanarak PBS (-) ile yıkayın. %1 sığır serum albümin/PBS (-) (%1 BSA) bir de 96-şey kültür plaka, 150 µL dökün ve hücre kültürü önce 1 h. için oda sıcaklığında kuluçkaya, % 1 BSA atın.Not: emin olun kuyuları tüm yüzeyine çözüm ile kaplıdır. 4. FEPE1L-8 hücre kültürü Not: aseptik koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin. K110 FEPE1L-8 hücrelerde 100 mm çanak CO2 kuluçka kültür ve 37 ° C ve % 5 CO2, yarı confluency için inkübe korumak. K110, tripsin ve tripsin inhibitörü olarak 37 ° C’de bir su banyosu hazırlamak Dikkatli bir şekilde orta kültür çanak kaldırmak, 3 mL % 0.05 tripsin bir pipet kullanarak ekleyin, CO2 kuluçka makinesine çanak yerleştirin ve 5 min için 37 ° C’de kuluçkaya. Kuluçka sonra faz kontrast mikroskobu 10 x büyütme oranında kullanarak kültür çanak yüzeyinden hücre dekolmanı denetleyin.Not: Müstakil hücre morfolojisi yuvarlak haline gelir. Hücreleri yaymak, 5 min ek bir süre için kuluçkaya. Tripsin inhibitörü 3 mL ekleyin ve bir pipet kullanarak 15 mL santrifüj tüpü müstakil hücrelerde toplamak. 15 mL santrifüj tüpü 200 x g 5 min için de hücrelerde santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve Pelet 10 bir pipet kullanarak mL K110 yeniden askıya alma. Faz kontrast mikroskobu 10 x büyütme oranında kullanarak hücreleri saymak ve 5.0 x 104 hücre/mL hücre konsantrasyonu ile K110 uygun seyreltme hazırlayın. Yavaşça K110 0.1 mL hücrelerde her şey kuyunun duvar boyunca bir pipet kullanarak kültür plaka ile tohum. Kültür plaka CO2 kuluçka makinesine koyun ve 37 ° C’de belirtilen süre (2 h, 1 gün, 3 gün) için kuluçkaya.Not: jelleri korumak için pipet ucu kuyu duvarı dokunmatik gerekir. 5. hücrelerin sayısı tahmini 37 ° C’de bir su banyosunda K110 kuluçkaya Mix 130 µL tetrazolium tuz, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodyum tuz (WST-8) ve K110 1.3 mL bir pipet kullanarak 2mL tüp içinde. Temiz bir Bank kültür plaka taşımak ve yavaşça K110 atın bir pipet kullanarak. Yavaşça K110 hücrelerle yapışık olmayan bir pipet kullanarak silsin Kültür plaka CO2 kuluçka makinesine koyun ve 37 ° c 2 h için kuluçkaya her şey bir pipet kullanırken K110 110 µL WST-8 ile karışık ekleyin. Kültür plaka taşımak için temiz bir Bank, klimalı orta 100 µL her kuyudan toplamak ve başka bir 96-şey kültür plaka bir kuyunun içine taşıyın. Ölçmek bir dalga boyunda 450 Absorbans Mikroplaka okuyucu ve tahmini hücrelerin sayısını kullanarak nm (OD450).

Representative Results

Tedavi kullanarak kültür yemekleri yüzeylerinin şematik gösterimi tip ı kollajen şekil 1′ de tasvir. Hücre türleri Morfoloji fibröz sigara ve fibril formları üzerinde gözlenen sırasıyla Şekil 2, sol ve sağ taraftaki kapı aynası mevcuttur. FEPE1L-8 hücreleri için 2 h (üst panelleri) ve 3 gün (alt panelleri) kültürlü. İlk kültür, 2s, hücreleri yapıştırılır ve kollajen (Şekil 2, üst panelleri) her iki formu üzerinde yayılmış. Tohum sonra üç gün fibröz sigara formdaki hücreleri yaymak ve artan numaraları (Şekil 2, alt sol panelde) hücre devam etti. Buna ek olarak, Fibriller formdaki hücreleri sınırlı (Şekil 2, alt doğru kapı aynası) yayılan gösterdi. FEPE1L-8 hücreleri çoğalırlar fibröz form türü üzerinde ben (şekil 3, düz siyah çizgi, siyah daireler kapalı) kolajen devam etti ve tedavi edilmezse çanak üzerinde (gri çizgi, kapalı gri daireler noktalıResim 3) yüzeyler. Buna ek olarak, hücre (şekil 3, noktalı çizgi, açık dairelerden) Fibriller formunda çoğalırlar değil. Şekil 2 ve şekil 3 Fujisaki ve ark11′ den değiştirildi. Resim 1 : Kültür çanak yüzeyler şematik gösterimleri tedavi türü ile ben kollajen. Asidik şartlar altında tip ı kollajen molekülleri adsorbe fibröz formu (sol panelde) bir çanak yüzeyi. 37 ° C’de tarafsız koşullarda, tip ı molekülleri liflerinde yeniden birleştirilen ve adsorbe kollajen yüzeyinde oluşan yemekler jel formunda (doğru kapı aynası). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : FEPE1L-8 hücre morfolojisi. K110 FEPE1L-8 hücrelerde kültürlü fibröz sigara formunu kullanarak (10 µg/mL; sol kapı aynası) veya Fibriller şeklinde (1 mg/mL; doğru kapı aynası) tip ı kollajen için 2 h (üst panelleri) ya da 3 gün (alt panelleri). Beyaz Çubuklarõn 100 µm. Şekil 2 modifiye edilmiştir Fujisaki ve ark. üzerinden Resim 1E-H11′. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : FEPE1L-8 hücre çoğalması. Hücrelerin sayısını fibröz formunda (siyah düz çizgi, siyah doldurulmuş daireler) tahmin edilmiştir veya üzerinde Fibriller (noktalı çizgi, açık Daire) şeklinde tip ı kollajen veya tedavi edilmemiş çanak yüzeyler (gri noktalı çizgi, gri dolgulu daireler) için 2 h, 1 gün ve 3 gün. Deneyler triplicates içinde gerçekleştirilen ve değerler gösterilir anlamına gelir + SD olarak Bu şekil şekil 1J11′ Fujisaki ve ark. üzerinden değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

ECM bileşenleri de dahil olmak üzere bazı tip ı kollajen, içinde vivo¹formu üç boyutlu yapılar. Böyle bir üç boyutlu kültür, jel substrat vitro daha fazla fizyolojik şartlarda iki boyutlu, plastik bir yüzeye sağlar¹^,²^,³^,⁴. Jel kültür yöntemi ile ilgili çok sayıda iletişim kuralları bildirilmiştir, kullanarak gibi tip ı kollajen¹^,²^,³^,⁴^,⁶^,⁷^, ¹¹, tip IV kollajen¹⁴^,¹⁵ve Matrigel¹⁶. Tip ı kollajen olduğunu iyi tanımlanmış ve yaygın olarak kullanılan malzeme onun bereket ve işleme kolaylığı nedeniyle. Saflaştırılmış türü özelliklerini ben kollajen hayvan türleri, yaş ve arıtma yöntemleri⁵^,¹⁷üzerinde bağlıdır. Tip ı kollajen saf Asetik asit ve/veya proteaz, pepsin, papain ve proctase⁵^,¹⁷gibi kullanarak. Asit çözünür kollajen amino-Telopeptid ve proteaz çözünür kollajen i ciddi amino-Telopeptid⁵^,¹⁷yaşındasın tutar. Amino-Telopeptid ayrılmış uzunluğu proteaz türüne bağlıdır ve fibril Morfoloji etkiler ve gücü⁵^,¹⁷jel Telopeptid varlığı. Asit çözünür kollajen liflerinde viskozite proteaz tedavi collagens¹⁷yüksektir. Bu çalışmada, biz asit çözünür kullanılan sığır tip ı kollajen. Pepsin çözündürüldükten kollajen bu jel kültür protokol için de kullanılabilir; Ancak, jel gücü zayıf¹⁷yaşında. Malzemeler bu farklılıkları hücre davranış farklılıklar neden olabilir, ama onlar şu anda değil de anlaşılır.

Bu çalışmada açıklanan jel kültür Protokolü çok basittir. Bu yöntemin birçok değişiklikler bildirilmiştir. Membran taklit etmek için lenfositi kültür için olası bir değişiklik olduğunu. Tip IV kollajen jelleri vitro¹⁵^,¹⁸‘ bir membran benzeri yüzey yapısını korumak için daha iyi olabilir. Ancak, uzun bir kuluçka dönemi türü IV kollajen jelleri¹⁴^,¹⁵^,¹⁸hazırlanması için gereklidir. Bunun yerine, tip IV kollajen ile karıştırma tip ı kollajen jelleri roman kültür yüzeylerde üretebilir (tip ı / IV kollajen hibrid jelleri türü)¹⁹. Bu melez jellerin kolay işlemek, kısa bir süre için jelleşme gerektirir ve daha fazla membran benzeri koşul lenfositi için verim. Açık tip ı / tip IV kollajen hibrid jelleri, keratinositler hayatta, koloniler oluştururlar ve terminal farklılaşma¹⁹ikna etmek. Bu karma yöntem çok yönlü uygulamalar vardır.

Jel üzerinde kültür kullanarak tip ı kollajen kanser hücreleri etkiler. Fibriller şeklinde üzerinde tip ı kollajen, Akt harekete geçirmek ve Caco-2 hücreleri (kolon kanseri hücre kültürünü) büyüme bastırılmış⁷. Buna ek olarak, Fibriller formdaki (M24met) insan Melanom hücrelerinin büyümesini G1/S denetim noktası²⁰tutulub. Ayrıca, Reaktif oksijen türleri, daha belirgin yüksek düzeyde Fibriller formunda kültürlü fare 3T3-L1 preadipocytes gözlenir. Ayrıca, hücre çoğalması ve geçiş ters yönde sigara-lifli tarafından uyarılır ve fibril formları tip ı kollajen²¹.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. K. Sekiguchi (Protein araştırmaları, Osaka Üniversitesi Enstitüsü), minnettarız Dr. M. Yamada (Protein araştırmaları, Osaka Üniversitesi Enstitüsü), Dr. T. Ikejima (Çin-Japonya Araştırma Enstitüsü, tıbbi ve eczacılık Bilimleri, Wuya Fakültesi Yenilik, Shenyang ilaç Üniversitesi) ve T. Hayashi (Çin-Japonya Araştırma Enstitüsü tıp ve eczacılık Bilimleri, Wuya yenilik üniversite, Shenyang ilaç Üniversitesi) yararlı yorumlar için.

Materials

Albumin, from bovine serum (BSA)	Merck KGaA	A4503
1 % BSA	Merck KGaA	A4503	Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	347-07621	tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8)
Collagen type I (Acid soluble collgen)	Nippi Inc.	ASC-1-100-20	from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL
disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate	ADVANTEC Co., LTD.	25CS020AS	0.2 µm pore size
human keratinocyte line cell FEPE1L-8			Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)
K-1	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin
K110 Type-II medium	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	keratinocyte basal culture medium
K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110)	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium
PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate
10x PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate
Penicillin-Streptomycin	MP Biomedicals, LLC	1670049	10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline
Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4	Merck KGaA	P-5368-10 pack
Trypsin from porcine pancreas	Merck KGaA	T4799
0.05 % trypsin	Merck KGaA	T4799	Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate
Trypsin inhibitor from soybean	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123
Trypsin inhibitor	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123	Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate

参考文献

Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
Kleinman, H. K., Haralsonand, M. A., Hassell, J. R., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. , 289-301 (1995).
Yamato, M., Hayashi, T., Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. , 123-140 (1998).
Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
Shih, Y. -. R., Tseng, K. F., Lai, H. -. Y., Lin, C. -. H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).
Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922 (2014).
Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
Hattori, S., et al. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. , (2015).
Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

記事を引用

Fujisaki, H., Futaki, S., Mizuno, K., Hattori, S. Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates. J. Vis. Exp. (146), e59339, doi:10.3791/59339 (2019).

Keratinosit yayılması üzerine iki ve üç boyutlu değerlendirilmesi tip ı kollajen yüzeylerde

概要

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

開示

Acknowledgements

Materials

参考文献

タグ

Play Video

記事を引用

View Video

Keratinosit yayılması üzerine iki ve üç boyutlu değerlendirilmesi tip ı kollajen yüzeylerde

概要

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

開示

Acknowledgements

Materials

参考文献

タグ

Play Video

記事を引用

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below