概要

Identificatie van Orexin en endocannabinoïde receptoren bij volwassen zebravis met behulp van immunoperoxidasekleuring en immunofluorescentie methoden

Published: June 25, 2019
doi:

概要

Hier gepresenteerd zijn protocollen voor immunohistochemische karakterisering en lokalisatie van orexin peptide, orexin receptoren, en endocannabinoïde receptoren in de darm en hersenen van normale en dieet-geïnduceerde obesitas (DIO) Adult zebravis modellen met behulp van immunoperixidase en dubbele immunofluorescentie methodes.

Abstract

Immunohistochemistry (IHC) is een zeer gevoelige en specifieke techniek betrokken bij de opsporing van doel-antigenen in weefselsecties met gelabelde antilichamen. Het is een multistep proces waarbij de optimalisering van elke stap cruciaal is om het optimale specifieke signaal te verkrijgen. Via IHC kunnen de distributie en lokalisatie van specifieke biomarkers worden gedetecteerd, waarbij informatie over evolutionaire instandhouding wordt onthuld. Bovendien staat IHC in voor het begrijpen van expressie-en distributie veranderingen van biomerkers in pathologische omstandigheden, zoals obesitas. IHC, hoofdzakelijk de immunofluorescentie techniek, kan gebruikt worden bij volwassen zebravis om de organisatie en distributie van door de moleculen bewaarde stoffen te detecteren, maar een standaard IHC-protocol is niet estasblished. Orexin en endocannabinoïde zijn twee sterk behouden systemen die betrokken zijn bij de controle van voedselinname en obesitas pathologie. Gemeld hier zijn protocollen die worden gebruikt om informatie te verkrijgen over orexin peptide (OXA), orexin receptor (OX-2R), en cannabinoïde receptor (CB1R) lokalisatie en distributie in de darm en de hersenen van de normale en dieet-geïnduceerde zwaarlijvige (DIO) volwassen zebravis modellen. Ook beschreven zijn methoden voor immunoperoxidasekleuring en dubbele immunofluorescentie, alsmede de voorbereiding van reagentia, fixatie, paraffine-inbedding, en cryoprotection van zebravis weefsel en de voorbereiding voor een endogene activiteit-blokkerende stap en achtergrond counterstaining. De volledige set van parameters is verkregen uit eerdere IHC experimenten, waardoor we hebben laten zien hoe immunofluorescentie kan helpen met het begrijpen van OXs, OX-2R, en CB1R distributie, lokalisatie, en het behoud van expressie in volwassen zebravis Weefsels. De resulterende beelden met zeer specifieke signaalintensiteit leidden tot de bevestiging dat zebravis geschikte dierlijke modellen voor immunohistochemische studies van distributie, localisatie, en evolutief behoud van specifieke biomarkers in fysiologische en pathologische omstandigheden. De hier gepresenteerde protocollen worden aanbevolen voor IHC experimenten bij volwassen zebravis.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) is een goed gevestigde klassieke techniek die wordt gebruikt om cellulaire of weefsel componenten (antigenen) te identificeren door antigeen-antilichaam interactie1,2. Het kan worden gebruikt om de lokalisatie en distributie van target biomoleculen te identificeren in een tissue. IHC gebruikt immunologische en chemische reacties om antigenen op te sporen in weefselsecties3. De belangrijkste tellers die voor de visualisatie van antigeen-antilichaam interactie worden gebruikt omvatten fluorescente kleurstoffen (immunofluorescentie) en enzym-substraat kleuren Reacties (immunoperoxidasekleuring), allebei geconjugeerd aan antilichamen4. Het gebruiken van microscopische observatie is mogelijk om de localisatie van geëtiketteerd weefsel te bepalen, dat ongeveer aan localisatie van het doel antigeen in het weefsel beantwoordt.

Twee methodes bestaan voor fluorescente of chromogene reacties om proteïne te ontdekken: de directe opsporingsmethode, waarin het specifieke primaire antilichaam direct wordt geëtiketteerde; en de indirecte opsporingsmethode, waarin het primaire antilichaam ongeconjugeerd is terwijl het secundaire antilichaam het etiket5,6,7draagt. De indirecte methode heeft sommige voordelen, die hoofdzakelijk zijn signaal versterking is. Bovendien, in tegenstelling tot andere moleculaire en cellulaire technieken, met immunofluorescentie, is het mogelijk om de distributie, de localisatie, en de coexpressie van twee of meer proteïnen te visualiseren die differentieel binnen cellen en weefsels worden uitgedrukt7. De keuze van de gebruikte detectiemethode is afhankelijk van experimentele Details.

Tot op heden, wordt IHC wijd gebruikt in fundamenteel onderzoek als krachtig en essentieel hulpmiddel om de distributie en de localisatie van biomarkers en het algemene profileren van verschillende proteïnen in biologisch weefsel van mens aan ongewervelden te begrijpen8, 9 , 10 , 11. de techniek helpt een kaart van eiwituitdrukking in een groot aantal normale en veranderde dierlijke organen en verschillende weefseltypes tonen, die mogelijke beneden-of omhoog-regulering van uitdrukking tonen die door fysiologische en pathologische veranderingen wordt veroorzaakt. IHC is een zeer gevoelige techniek die nauwkeurigheid en de juiste keuze van methoden vereist om optimale resultaten te verkrijgen12. Eerst en vooral, kunnen vele verschillende factoren zoals bevestiging, dwars-reactiviteit, antigeen herwinning, en gevoeligheid van antilichamen tot valse positieve en valse negatieve signalen13leiden. De selectie van de antilichamen is één van de belangrijkste stappen in IHC en hangt van de antigeenspecificiteit en zijn affiniteit af aan de proteïne en de soorten onder onderzoek7.

Onlangs, hebben wij de IHC techniek geoptimaliseerd om leden van orexin/hypocretine en endocannabinoïde systemen in volwassen zebravis weefsel te ontdekken. We hebben vooral gericht op fixatie, weefsel inbedding met behulp van twee verschillende benaderingen, secties en montage (die van invloed kunnen zijn resolutie en detail tijdens microscopische analyse), en het blokkeren (om valse positieven te voorkomen en te verminderen achtergrond)14. Andere belangrijke kenmerken zijn de antilichamenspecificiteit en selectiviteit en reproduceerbaarheid van individuele IHC protocollen. De sleutel tot het verstrekken van antilichaam specificiteit is het gebruik van negatieve controles (met inbegrip van geen primaire antilichamen of weefsel waarvan bekend is dat niet de doelstelling eiwitten uitdrukken), alsmede positieve controles (met inbegrip van weefsel dat bekend is om de doel-eiwitten uit te drukken)15 . De selectie van antilichamen voor IHC wordt gemaakt op basis van hun soort-specificiteit (de waarschijnlijkheid waarmee zij met het antigeen van belang reageren) en de antigeen-antilichaam bindende opsporingssystemen die4,5,6 worden gebruikt ,7. In het geval van immunoperoxidasekleuring, wordt de kleur van de reactie bepaald door selectie van neerslaan chromogeen, gewoonlijk diaminobenzidine (bruin)16. Enerzijds, gebruikt immunofluorescence antilichamen die met een fluorophor worden vervoegd om eiwituitdrukking in bevroren weefselsecties te visualiseren en maakt voor gemakkelijke analyse van veelvoudige proteïnen met betrekking tot het chromogene opsporingssysteem mogelijk 5 , 7.

In de immunoperoxidasekleuring techniek, het secundaire antilichaam is geconjugeerd aan biotine, een linker molecuul in staat van aanwerving van een chromogene reporter molecule [avidin-Biotine complex (ABC)], wat leidt tot versterking van de kleuring signaal. Met de ABC reporter methode, reageert het enzym peroxidase met 3, 3 ‘-diaminobenzidine (schar), producerend een intens bruin-gekleurde kleuring waar het enzym aan het secundaire antilichaam bindt, dat dan met een gewone lichte Microscoop kan worden geanalyseerd. ABC die, wegens de hoge affiniteit van avidin voor Biotine bevlekt, veroorzaakt een snelle en optimale reactie, met weinig secundaire antilichamen verbonden aan de plaats van de primaire antilichaam reactiviteit. Deze chromogene detectiemethode zorgt voor de densitometric analyse van het signaal, het verstrekken van semi-kwantitatieve gegevens op basis van de correlatie van bruine signaalniveaus met eiwitexpressie niveaus18.

Met immunofluorescentie technieken, gelijktijdige opsporing van veelvoudige proteïnen is mogelijk toe te schrijven aan de capaciteit van verschillende fluorochromes om licht bij unieke golflengten uit te stoten, maar is belangrijk om fluorochromes zorgvuldig te kiezen om spectrale overlapping te minimaliseren 5. Bovendien minimaliseert het gebruik van primaire antilichamen in verschillende gastheer soorten problemen met betrekking tot cross-reactiviteit. In dit geval, erkent elk soort-specifiek secundair antilichaam slechts één type van primair antilichaam. Fluorescerende verslaggevers zijn kleine organische moleculen, waaronder commerciële derivaten, zoals Alexa Fluor kleurstoffen.

Vele dierlijke modellen worden gebruikt om bepaalde fysiologische en pathologische voorwaarden te begrijpen. Tot op heden is vastgesteld dat veel metabole routes worden bewaard in de loop van de evolutie. Daarom kan IHC studies in modelorganismen zoals zebravis inzicht verschaffen in het ontstaan en het onderhoud van pathologische en niet-pathologische omstandigheden17. Het is een doel van dit rapport om IHC-protocollen te illustreren die kunnen worden uitgevoerd op volwassen zebravis weefsel en worden gebruikt om gedetailleerde beelden te verkrijgen van de distributie en lokalisatie van OXA, OX-2R en CB1R op perifere en centrale niveaus. Ook gemeld zijn protocollen voor de toepassing van twee grote IHC indirecte methoden in perifere en centrale weefsels van volwassen zebravis. Beschreven is de indirecte methode, die voor signaal versterking in gevallen toestaat waar een secundair antilichaam aan een fluorescente kleurstof (immunofluorescentie methode) of enzym Reporter (immunoperoxidasekleuring methode) wordt vervoegd. Zowel chromogene als fluorescente opsporingsmethodes bezitten voordelen en nadelen. Gerapporteerd in dit protocol is het gebruik van IHC, hoofdzakelijk immunofluorescentie, in volwassen zebravis, een dierlijk model dat wijd wordt gebruikt om systemen te bestuderen die evolutief behouden over verschillende fysiologische en pathologische voorwaarden zijn.

Protocol

1. immunoperoxidasekleuring Protocol Nota: zebravis werd verkregen door Prof. Omid Safari (Ministerie van visserij, Faculteit van natuurlijke rijkdommen en milieu, Ferdowsi Universiteit van Mashhad, Mashhad, Iran)10. Weefsel dissectie Offer de zebravis door onderdompeling in ijswater (5 delen ijs/1 deel water, 4 °C); laat ze tot beëindiging van alle verkeer om de dood te waarborgen door hypoxie. Verwijder snel de darm en…

Representative Results

Representatieve gegevens voor de immunoperoxidasekleuring kleuring worden weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. Immunohistochemische analyse van OX-A en OX-2R distributie in de darm van volwassen zebravis toonde verschillende lokalisatie sites van OX-A en OX-2R en hun toename in expressie in de intestinale cellen van DIO zebravis. Een intense bruine kleuring voor OX-A werd waargenomen in de cellen van de mediale en voorste darm (Figuur 1a</st…

Discussion

Monstervoorbereiding

De voorbereiding van de steekproef is de eerste kritieke stap in IHC. Een betrouwbare protocol zorgt voor het onderhoud van de cel morfologie, weefsel architectuur, en antigenicity. Deze stap vereist juiste weefsel inzameling, bevestiging, en sectioning22,23. Het doel van fixatie is het behoud van weefsel en het verminderen van de werking van weefsel enzymen of micro-organismen. In het bijzo…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, Universiteit van Sannio.

Materials

Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

参考文献

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry–the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J., Howard, G. C., Kaser, M. R. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O’Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Play Video

記事を引用
Imperatore, R., D’Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

View Video