Visualización del surco Ocular Superior durante la embriogénesis de Danio rerio
概要
Aquí, presentamos una serie estandarizada de protocolos para observar el surco ocular superior, una estructura recientemente identificadas, conservadas evolutivamente en el ojo vertebrado. Con larvas de pez cebra, demostramos técnicas necesarias para identificar los factores que contribuyen a la formación y cierre del surco ocular superior.
Abstract
Coloboma ocular congénito es un trastorno genético que típicamente se observa como una hendidura en el aspecto inferior del ojo resultante cierre de fisura coroide incompleta. Recientemente, la identificación de individuos con coloboma en el aspecto superior del iris, retina y lente conducido al descubrimiento de una nueva estructura, denominada la fisura superior o surco ocular superior (SOS), que es transitorio presente en el dorsal aspecto de la Copa óptica durante el desarrollo del ojo vertebrado. Aunque esta estructura se conserva en ratones, pollos, pescados y newt, nuestra comprensión actual de los SOS es limitada. Con el fin de dilucidar los factores que contribuyen a su formación y cierre, es imprescindible para poder observar e identificar anormalidades, tales como retraso en el cierre de la SOS. Aquí, nos propusimos para crear una serie estandarizada de protocolos que puede utilizarse para visualizar eficientemente el SOS combinando técnicas de microscopía disponible con técnicas de biología molecular comunes tales como coloración inmunofluorescente y mRNA sobreexpresión. Mientras que este conjunto de protocolos se centra en la capacidad de observar el retardo de cierre de SOS, es adaptable a las necesidades del experimentador y pueden modificarse fácilmente. En general, esperamos crear un método accesible a través del cual se puede avanzar nuestra comprensión de la SOS para ampliar el conocimiento actual del desarrollo del ojo vertebrado.
Introduction
La formación del ojo vertebrado es un proceso altamente conservado en que vías de señalización intercelulares cuidadosamente orquestadas establecen tipos de tejidos y especifican identidad regional1. Perturbaciones a la morfogénesis temprana de ojo provocar defectos profundos en la arquitectura del ojo y con frecuencia son ciego2. Una de esas enfermedades resultado de la falta para cerrar la fisura ocular coroide en la parte ventral de la taza óptica3. Este trastorno, conocido como coloboma ocular, se estima para ocurrir en 1 fuera de 4-5000 nacidos vivos y causa el 3-11% de ceguera pediátrica, que se manifiesta comúnmente como una ojo de la cerradura-como la estructura que sobresale en parte inferior de la pupila en el centro del ojo4, 5,6. La función de la fisura coroide es proporcionar un punto de entrada de vasculatura temprana creciendo en la Copa óptica, después de que los lados de la fisura fusible para incluir los vasos7.
Mientras que el coloboma ocular ha sido conocido desde la antigüedad, recientemente hemos identificado un nuevo subconjunto de pacientes con coloboma con pérdida de tejido que afectan el aspecto dorsal superior del ojo. Trabajos recientes en nuestro laboratorio ha conducido al descubrimiento de una estructura ocular en el ojo dorsal del pez cebra, que llamamos el surco ocular superior (SOS) o fisura superior8. Es importante tener en cuenta que la estructura tiene características de un surco y una fisura. Similar a un surco, es una capa de tejido continuo que abarca desde la nasal de la retina temporal. Además, el cierre de la estructura no está mediado por una fusión de los dos opuestos de la membrana del sótano, y que parece requerir un proceso morfogenético por que la estructura está poblada por las células. Sin embargo, similar a una fisura, forma una estructura que separa las partes nasal y temporales del ojo dorsal con la membrana basal. Coherencia, nos referiremos a él como SOS en este texto.
El SOS es evolutivamente conservado en vertebrados, siendo visible durante la morfogénesis de ojo de pescado, pollo, newt y mouse8. En contraste con la fisura coroide, que está presente desde la fecundación después de 20-60 horas (hpf) en el pez cebra, el SOS es muy transitorio, visible de 20-23 hpf y ausente por hpf 268. Investigaciones recientes en nuestro laboratorio ha encontrado que, similar a la fisura de la coroide, el SOS desempeña un papel en dirección vascular durante la morfogénesis de ojo8. Aunque los factores que controlan la formación y el cierre del SOS no se entienden todavía completamente, nuestros datos destacan papeles ojo dorsal ventral patrones genes8.
Pez cebra es un organismo modelo excelente para estudiar el SOS. Como sistema modelo, ofrece una serie de ventajas en el estudio de desarrollo del ojo: es un modelo vertebrado; cada generación presenta alta fecundidad (~ 200 embriones); su genoma se ha secuenciado completamente lo que facilita la manipulación genética; y aproximadamente el 70% de los genes humanos tienen al menos un pez cebra orthologue, convirtiéndolo en un modelo ideal basado en la genética de la enfermedad humana9,10. Lo más importante, su desarrollo lleva a cabo externamente a la madre, y sus larvas son transparentes, que permite la visualización del ojo en desarrollo con relativa facilidad11.
En este conjunto de protocolos, se describen las técnicas a través del cual se puede visualizar el SOS en larvas de pez cebra. La variedad de técnicas de visualización utilizado en este informe permitirá observación clara de los SOS durante el desarrollo normal del ojo, así como la capacidad para detectar defectos de cierre de SOS. Nuestros protocolos de ejemplo contará con investigaciones de Gdf6, un BMP localizada en la dorsal ojos y conocido regulador de cierre de SOS. Además, estas técnicas pueden combinarse con manipulaciones experimentales para identificar factores genéticos o agentes farmacológicos que afectan el cierre y la correcta formación de SOS. Además, hemos incluido un protocolo mediante el cual la imagen fluorescente de todas las membranas celulares es posible, lo que permite al experimentador observar cambios morfológicos en las células que rodean el SOS. Nuestro objetivo es establecer una serie de protocolos estandarizados que pueden utilizarse en toda la comunidad científica para ofrecer nuevas penetraciones en la estructura de novela del ojo en desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos una serie estandarizada de protocolos para observar el SOS en el embrión de pez cebra en desarrollo. Para determinar fenotipos de retardo de cierre, los protocolos se han centrado en la capacidad de distinguir la separación de dos lóbulos discretos de los lados del ojo, similar a las técnicas utilizadas para visualizar retardo de cierre de fisura coroide nasal dorsal y dorsal-temporal fenotipos en la vista ventral.
Estas técnicas de visualización pueden utilizarse junt…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR), ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC), Alberta Innova tecnología futuros y la mujer e Instituto de investigación de salud (WCHRI de los niños).
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
参考文献
- Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
