生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化
概要
生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans にわたってゼラチナーゼ活性の白血球の遊走に関与する血液-脳関門の透過性を確認する方法に取り組みます。
Abstract
単位 (NVU) は血液-脳関門 (BBB) 埋め込みペリサイトの内皮の基底膜を形成微小血管内皮細胞で構成され、グリア limitans 実質の基底膜とアストロ サイトの構成エンドフィード中枢神経系 (CNS) 微小血管の abluminal 側面を採用します。中枢神経系を維持するために加えて、NVU の恒常性は、免疫細胞が中枢神経系に人身売買を制御します。食餌中枢神経系の中に活性化リンパ球の数が少ないは BBB の機能不全や臨床疾患を引き起こすことがなく内皮の障壁を越えることができます。対照的に、多発性硬化症の動物モデルとしてなど neuroinflammation 中実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) の免疫細胞の数が多いことが出来る BBB とその後中枢神経系柔に最終的に到達するグリア細胞 limitans臨床病気に 。 中枢神経系細胞に免疫細胞の移動、異なる分子メカニズムを用いる NVU の内皮細胞およびグリア細胞の境界を越えたシーケンシャル移行は、2 段階のプロセスです。内皮バリアを越えた次の通路、T 細胞が発生するローカル再活動開始以降機構 gelatinases の焦点の活性化につながる血管抗原提示細胞上の同種抗原をグリアの関門を通過して中枢神経系実質 T 細胞になります。したがって、BBB 透過性と EAE の中に中枢神経系の免疫細胞集積に対する空間相関の MMP 活性の両方を評価する、NVU の内皮細胞およびグリアの障壁の完全性の損失を指定することができます。 能動免疫による c57bl/6 マウスに惹起を誘導する方法、およびその後 BBB 透過性外因性蛍光トレーサーの組み合わせを使用して体内を分析する方法を示します。我々 はさらに表示、視覚化および原 zymogaphy BBB 基底膜と CD45 + 侵略免疫細胞の免疫蛍光染色に結合によって EAE 脳中のゼラチナーゼ活性をローカライズする方法。
Introduction
中枢神経系 (CNS) は、すべてのボディおよび脊椎動物、精神機能を調整し、恒常性中枢神経系は神経細胞の適切なコミュニケーションのために不可欠。中枢神経系の恒常性は、血流の変化の環境から中枢神経系を保護する神経血管ユニット (NVU) によって保証されます。NVU は、ユニークな生化学的、連続クロストーク ペリサイト, アストロ サイト, ニューロン, と細胞外マトリックス (ECM) の血液脳関門 (BBB) を確立、中枢神経系血管内皮細胞ので構成されます 2 つの確立異なる基底膜1。内皮細胞基底膜 abluminal BBB 内皮細胞においてペリサイトの高番号を隠し持ってし、ラミニン α4 とラミニン α 5、に加えて他の ECM 蛋白質2で構成されて、ensheathes。対照的に、実質の基底膜はラミニン α 1 とラミニン α 2 から成り、アストロ サイト終わり足に包まれています。アストロ サイトのエンド フィートと共に実質の基底膜は、いっぱい脳脊髄血管周囲またはくも膜下スペース3から中枢神経系の神経ネットワークを分離するグリア細胞 limitans を作成します。人身売買の中枢神経系に免疫細胞は、末梢組織に免疫細胞で 2 段階のプロセスが必要とする、まず違反内皮 BBB とその後にグリア細胞 limitans とは異なる、NVU のユニークなアーキテクチャにより中枢神経系細胞に達する。
多発性硬化症 (MS) は中枢神経系、免疫細胞の数が多いが中枢神経系に入力し、neuroinflammation、脱髄、BBB 整合性4の焦点の損失を引き起こすの一般的なアミロイド疾患です。ガドリニウム コントラスト強化磁気共鳴画像 (MRI)5によって可視化として中枢神経系病変の存在によって示されるように、BBB の整合性の損失は MS の初期の特徴です。後毛細管小静脈; のレベルで中枢神経系に白血球の血管外漏出が発生しますただし、BBB 基底膜およびその後グリアのバリア間で免疫細胞漏出に関与する正確なメカニズムは、探検するために残ります。実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) MS の動物モデルとして機能し、MS の病因について私達の現在の知識に大きく貢献しています。例えば、EAE モデルを使用して発見されている最初のキャプチャを含むマルチ ステップ プロセスで白血球の血管外漏出が発生して注目していると P セレクチン糖タンパク質リガンド (PSGL)-1 などの粘液のような分子を介するローリング ステップインテグリン依存型会社逮捕と漏出6の寛容な側面に BBB 内皮細胞の T 細胞のクロールの順。
T 細胞は、血管内皮の BBB と内皮の基底膜に交差している、彼らの同種抗原マクロファージや樹状細胞が髄膜や血管周囲のスペースで戦略的にローカライズに遭遇する必要があります。この相互作用は、炎症性メディエーターの焦点生産グリア limitans7,8,9を介して免疫細胞の中枢神経系組織への浸潤のため後続のメカニズムに必要なトリガーを誘導します。マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP)-2 および mmp-9 活性化焦点ケモカイン活性化を変更し、免疫の前提条件であるアストロ サイトの終わり足細胞外マトリックス受容体の分解を誘導する全体にグリア細胞 limitans 細胞移動、細胞、中枢神経系の実質および EAE10,11の臨床症状の発症を誘発します。
中枢神経系ティッシュ セクションの漏れとゼラチナーゼ活性 CNS BBB と免疫細胞の浸潤の検出を組み合わせた neuroinflammation のコンテキストで内皮細胞およびグリア細胞のバリアの機能の整合性に関する貴重な情報を提供します。例えば、最近調べた内皮タイト結合分子接合部接着分子 (ジャム) の構成の損失-EAE のコンテキストで人身売買、中枢神経系には免疫細胞の B。健康の野生型 c57bl/6 マウスと比較して、健康的なジャム B 欠乏同腹子を示さなかった BBB 整合性の減損内因性と外因性トレーサー12を使用して体内の透水性評価が示すように。EAE のコンテキストでジャム B 欠乏 c57bl/6 マウスは炎症細胞髄膜と血管周囲のスペース12トラップに関連付けられていた改善病気の徴候を示した。この現象を確認する適用の in situザイモグラフィー ジャム B 欠損マウス中のゼラチナーゼ活性の欠如が突破することが免疫細胞の数が減少する可能性がある場合をテストするためにゼラチナーゼ活性の同定を可能、グリア limitans12。
可用性を与え異なる遺伝子組み換えマウスのモデル、例えば、BBB 機能の変化を引き起こす可能性があります別の BBB タイト結合分子を欠けている BBB の整合性を調査するための方法論は、重要。さらに、新しく開発された薬 NVU 障壁に影響を与える可能性があります。ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) による能動免疫による c57bl/6 マウスに惹起を誘導する方法を紹介-ペプチド aa35-55 Freund 完全アジュバントで。我々 は、外因性トレーサーとゼラチナーゼ活性の in situ 検出による内皮細胞およびグリア細胞の体内バリアの整合性をそれぞれ勉強の仕方、NVU の内皮細胞およびグリアの垣根を越えて免疫細胞浸潤をローカライズする方法を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、誘導し、女性の c57bl/6 マウスに惹起を監視するためのプロトコルを提案する.女性が優先的に選択されていると、女性の発症率がある: 3:1 MS での男性。EAE の重症度を評価するために行った 3 点得点シートの使用します。EAE の重大度は、運動機能障害の重症度に関してスコアは一般的にです。マウス先端 EAE の段階、すなわち 2 の上のスコアを示す動物の不必要な苦痛を避けるため?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
リディア ・ ソローキン、私たちと彼女オリジナルの in situザイモグラフィー プロトコル10共有者は心より感謝します。
Materials
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
参考文献
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
- Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
- Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. 神経科学. , (2017).
- Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
- Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
- Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
- Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
- Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
- Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
- Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
- Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
- Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, (2007).
- Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
- Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis–a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
- Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
- Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
- Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
- Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
- Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
- Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
- Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
- Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
- Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
- Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).
