Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Hier beschrijven we een eenvoudige methode die we hebben ontwikkeld om in vivo gencontrole van neuronale cytoarchitectuur te ontleden. Op basis van in vitro engineering van neuronale precursoren, hun transplantatie in neonatale hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van “test” en “Control” cellen, maakt het mogelijk om functionele implicaties van test genen te onthullen in de fijne beheersing van neuronale morfologie in een snelle en betaalbare manier. Om in vivo gencontrole van neuronale architectuur te onderzoeken, moeten drie belangrijke technische kwesties worden aangepakt: (1) het bereiken van een adequaat gedessineerde gen-of-Interest (GOI) expressie en een nauwkeurige kwantitatieve controle ervan; (2) het verkrijgen van een correct gesegmenteerde visualisatie van verschillende neuronale silhouetten; (3) het opwekken van statistische significantie van de resultaten terwijl een beperkt aantal dieren wordt tewerkstelt.

Indien beschikbaar, muis Mutant lijnen cellen tetracycline (tet)-gecontroleerde transgenes mogelijk de beste tool om het eerste nummer¹aan te pakken. Als alternatief kan somatische Transgenese worden gebruikt. In dergelijke gevallen wordt het transgen geleverd via electroporatie² of virale transductie³. Vervolgens wordt het bewaard als een episome (bijv. bij standaard elektroporation⁴), of het is geïntegreerd in het genoom (willekeurig, via retrovirale integrase⁵; of op een gedefinieerde locatie, via crispr-gepromoveerde homologe RECOMBINATIE (slendr)⁶ ).

Tweede, neuronale silhouet visualisatie kan worden bereikt via (a) sparse uniforme labeling of (b) dichte differentiële labeling. Wat betreft sparse labeling, geavanceerde Golgi-achtige methodologieën kunnen worden gebruikt⁷, geselecteerde neuronale minisets kunnen worden gevuld door biocytine⁸, en zout-en-peper labeling kan worden verkregen dankzij een dun uitgedrukt transgene. Een dergelijk transgen kan bonte transcriptie (Thy-EGFP)⁹ vertonen of kan worden geactiveerd door stochastische recombinatie (Morf)¹⁰. Als voor (b), State of Art strategieën omvatten CRE-gemedieerde stochastische recombinatie binnen een multi-floxed fluoroprotein transgen array (brainbow)¹¹, evenals piggybac-transposase-driven genomische integratie van fluoroprotein genen, eerder geleverd via somatische Transgenese (kloon)¹².

Wat betreft het derde probleem, wordt de morometrische uitkomst vaak beïnvloed door een grote willekeurige variabiliteit, afkomstig van verschillen tussen dieren en contingenties van de celinjectie. Hierdoor wordt een groot aantal dieren gewoonlijk gebruikt om het statistische vermogen te bereiken dat nodig is om de werking van de GOI-Morfometrische activiteit te beoordelen.

De eerder beschreven benaderingen zijn vaak gebaseerd op geavanceerde technische vaardigheden en vereisen opvallende financiële middelen, die hun verspreiding binnen de wetenschappelijke gemeenschap kunnen beperken. Om deze problemen te omzeilen, hebben we een eenvoudige en ongecompliceerde pijpleiding bedacht om op een snelle en betaalbare manier de genbeheersing van neuro architectuur in vivo te ontleden. Dit is geïnspireerd door een soortgelijk co-transplantatie ontwerp dat eerder is ontwikkeld voor een snelle in vivo evaluatie van antiblastische transgen activiteit¹³.

Specifiek, er wordt gedacht dat de co-transplantatie van in vitro engineered “groene” neurale precursoren (“test” en “controle” cellen) in een “zwarte” ontvangende neonatale hersenen kunnen tegelijkertijd de drie belangrijkste problemen die hierboven vermeld. In vitro lentivirale engineering van precursoren, in goed gecontroleerde omstandigheden, maakt het mogelijk om de variabiliteit van neuronale transgenexpressie minimaal te onderhouden, ver onder die meestal geassocieerd met somatische manipulaties (eerder uitgevoerd ^{14 , 15} en in onze niet-gepubliceerde resultaten). De resulterende nauwkeurige controle van genexpressie is vergelijkbaar met die bereikt door Tet-gecontroleerde transgene modellen. De kosten van deze procedure liggen echter ver onder die van het onderhoud van een transgene muis lijn. Volgende, vrije-hand celinjectie is eenvoudig en vereist minimale training. Bovendien kan de hoeveelheid gelabelde precursoren die in elke hersenen worden geïnjecteerd, gemakkelijk worden afgestemd om een voldoende Cumulatief aantal dunbevolkte precursoren te bereiken, terwijl ook het totale aantal getransplanteerde dieren minimaal blijft. Niet in de laatste plaats, co-injectie van verschillend fluoro-gelabeld, “test”-en “controle”-precursoren en daaropvolgende Pairwise statistische analyse van de resultaten neutraliseren de effecten van de experimentele variabiliteit van de Inter-Animal, waardoor het bereiken van statistische significantie van de resultaten, zelfs bij de analyse van een beperkt aantal personen¹³.

Benadrukt moet worden dat deze methode, zij het snel en voordelig, twee belangrijke beperkingen heeft. Ten eerste is het ontworpen om de celautonome gencontrole van neuronale architectuur te onderzoeken, en het is niet gepast om de milieucontrole aan te pakken. Ten tweede, aangezien getransplanteerde neuronale precursoren hun uiteindelijke locatie bereiken met een heterochronisch schema, verdient deze methode de voorkeur om neuroarchitectonische controle te modelleren die plaatsvindt na voltooiing van de migratie.