概要

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Published: March 05, 2019
doi:

概要

Memeli hücre HeLa hücreleri kullanarak döngüsü sırasında eğitim RNA-interactors için çift iplikçikli RNA bağlayıcı protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek ve deneysel yaklaşımlar mevcut. Formaldehit crosslink RNA-PKR kompleksleri ve immunoprecipitation PKR bağımlı RNA’ların zenginleştirmek için bu yöntemi kullanır. Bu RNA’ların daha da yüksek üretilen iş sıralama veya qRT-PCR ile çözümlenebilir.

Abstract

Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek doğuştan gelen bağışıklık yanıtı proteinler üyesidir ve viral RNA’ların çift iplikçikli ikincil yapısını tanır. Viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs) bağlandığında, PKR dimerization ve sonraki autophosphorylation uğrar. Fosforile PKR (pPKR) aktif hale gelir ve fosforilasyon bir alfa alt birimi ökaryotik başlama Factor global çeviri bastırmak için 2 (eIF2α) neden olmaktadır. Kanıt artan PKR hücre döngüsü sırasında gibi fizyolojik koşullar altında veya enfeksiyonu olmadan çeşitli stres koşullarında etkinleştirilebilir öneriyor. Ancak, PKR RNA aktivatörler anlayışımızı yakalamak ve PKR etkileşim dsRNAs analiz için standart bir deneysel yöntem eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Burada, bir deneysel mevcut özellikle zenginleştirmek ve PKR çözümlemek için iletişim kuralı bağlı RNA’ların HeLa hücreleri kullanarak hücre döngüsü sırasında. Biz verimli crosslinking etkinlik formaldehit PKR-RNA kompleksleri düzeltmek ve onları immunoprecipitation yolu ile izole etmek için kullanmaktadır. PKR co-immunoprecipitated RNA’ların daha da yüksek üretilen iş sıralama kitaplığı oluşturmak için işlenebilir. Bir büyük PKR etkileşim hücresel dsRNAs (mtRNAs), hangi cins dsRNAs ağır iplikçik ve ışık iplikçikli RNA’ların arasında tamamlayıcı etkileşimi aracılığıyla olarak bulunabilir mitokondrial RNA’lar sınıfıdır. Bu çift yönlü mtRNAs strandedness çalışmaya da strand özgü qRT-PCR için bir iletişim kuralı mevcut. Bizim iletişim kuralı PKR bağımlı RNA’ların analizi için optimize edilmiştir, ama hücresel dsRNAs veya RNA-interactors diğer dsRNA bağlayıcı proteinlerin eğitimi için kolayca değiştirilebilir.

Introduction

Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek, olarak da bilinen ökaryotik başlama faktör 2-Alfa kinaz 2 (EIF2AK2), RNA’ların tarafından sağlanan bilgi ileten bir iyi karakterize protein kinaz var. Ökaryotik çeviri başlatma 2 alt birim alfa (eIF2α) ait kinaz aile ve serin 51 yanıt olarak küresel çeviri1bastırmak için enfeksiyon, eIF2α phosphorylates. Bu bağlamda, PKR PKR dimerization ve autophosphorylation2için bir platform sağlamak viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs), tarafından etkinleştirilir. EIF2α ek olarak, PKR da p53, insülin reseptör substrat 1, inhibitörü κB ve c-Jun N-terminal kinaz (JNK) çok sayıda sinyal iletim yollarının3,4,5, etkinliği düzenleyen fazdan 6.

PKR aslında poliovirus’dsRNAs7,8tanıyarak poliovirus enfeksiyon sırasında eIF2α fosforile kinaz olarak tespit edilmiştir. PKR giderek bağışıklık yanıtı ötesinde çok yönlü rolleri oynamak için bulunur ve onun anormal harekete geçirmek ya da arıza çok sayıda insan hastalıklarda ima etti. Aktif/Phosphorylated PKR (pPKR) apoptosis sırasında sık sık gözlenen ve dejeneratif hastalıklar, özellikle gibi Huntington nörodejeneratif hastalıklar, Parkinson’ın ve Alzheimer hastalığı9 hastalarda genel özelliği olduğunu ,10,11,12,13. Buna ek olarak, PKR metabolik stres ve ısı şok14,15,16,17gibi çeşitli stres koşullarında etkinleştirilir. Öte yandan, PKR inhibisyonu artan hücre çoğalması ve hatta Malign transformasyon18,19ile sonuçlanır. PKR işlevi de normal beyin işlevinde önemli ve pPKR düzeyi olarak hücre döngüsü sırasında sırasında M faz20,21,22yükseltilmiş. Bu bağlamda pPKR küresel çeviri bastırır ve uygun hücre bölünmesi20için gerekli olan anahtar Mitotik sinyal sistemleri için ipuçları sağlar. Ayrıca, uzun süreli PKR aktivasyonu hücre döngüsü tutuklama Çin hamster yumurtalık içinde23hücreleri G2/M aşamasında sonuçlandı. Sonuç olarak, PKR fosforilasyon sırasında M/G1 geçiş21hızlı devre dışı bırakma sağlamak için negatif geribesleme tarafından düzenlenmiştir.

PKR geniş aralığı işlevi rağmen PKR harekete geçirmek anlayışımızı yakalamak ve PKR etkinleştirebilirsiniz dsRNAs tanımlamak için standart yüksek üretilen iş deneysel yaklaşım eksikliği nedeniyle sınırlıdır. PKR iki ters Alu yineler (IRAlus)20,24, ama PKR hücre döngüsü sırasında veya altında etkinleştirebilirsiniz ek hücresel dsRNAs varlığı olasılığını tarafından kurulan dsRNAs ile etkileşim kurabilir önceki çalışmalar göstermiştir insan hücreleri stres koşullarında keşfedilmemiş. RNA-interactors bir RNA bağlayıcı protein (RBP) belirlenmesinde geleneksel yaklaşım UV ışık crosslink RNA-RBP kompleksleri25,26,27için kullanılır. Yeni yapılan bir çalışmada bu UV crosslinking yaklaşım bir fare sisteminde uygulanan ve küçük genelde RNA’ların PKR etkinleştirme sırasında metabolik stres16düzenleyen teşhis etti. Formaldehit verimliliğini yüksek crosslinking kullanarak, biz PKR etkileşim RNA’ların HeLa hücreleri28Hücre döngüsünde sırasında tanımlamak için alternatif bir yöntem sundu. Benzer bir yaklaşım Staufen ve Drosha29,30,31gibi diğer dsRBPs çalışma uygulandı. Bulduğumuz gibi kısa serpiştirilmiş nükleer öğesi (sinüs), uzun Nükleer öğesi (satır), endojen retrovirüsü öğesi (modül) ve hatta Alfa-uydu RNA’ların serpiştirilmiş PKR kodlamayan RNA’ların türleri ile etkileşim kurabilir. Buna ek olarak, biz PKR ağır iplikçik ve ışık arasında tamamlayıcı etkileşimi aracılığıyla hangi formu cins dsRNAs RNA’ların28strand mitokondrial RNA’lar ile (mtRNAs), etkileşim içinde olduğunu gösterdi. Son yayın daha fazla desteklenen bizim veri bazı mtRNAs bir çift yönlü formunda yer alan ve dsRNA sensörleri interferonlar32ikna etmek için Melanom farklılaşma ilişkili protein 5 gibi etkinleştirebilirsiniz. Daha da önemlisi, ifade ve mtRNAs hücre altı yerelleştirme hücre döngüsü sırasında ve tarafından çeşitli stresler, PKR harekete geçirmek28düzenleyen yeteneğini önemli olabilecek modülasyonlu.

Bu makalede, biz son zamanlarda geliştirilen formaldehit crosslinking ve immunoprecipitation (fCLIP) için detaylı bir protokolü mevcut yakalamak ve RNA’ların PKR etkileşim hücre döngüsü sırasında analiz yöntemi. Hücre döngüsü tutuklama örnekleri timidin ve nocodazole kullanarak hazırlamak için yöntemi göstermektedir. Biz o zaman fCLIP işleminin PKR bağımlı RNA’ların ve bu RNA’ları tanımlamak için bir yöntem yüksek üretilen iş sıralama kitaplığı hazırlamak için izole etmek için mevcut. Ayrıca, biz PKR bağımlı RNA’ların qRT-PCR kullanarak analiz ile ilgili ayrıntılı yordamlar betimlemek. Özellikle, biz mtRNAs strandedness analiz etmek için bir iplikçik özgü ters transkripsiyon yordam mevcut. Açıklanan protokol HeLa hücreleri ve PKR için optimize edilmiştir, ancak hücre döngüsü örnek, fCLIP ve strand özgü qRT-PCR analizleri hazırlanması gibi önemli adımlar kolayca hücresel dsRNAs çalışmaya ya da diğer dsRBPs, RNA interactors belirlemek için değiştirilebilir.

Protocol

1. çözüm ve hücre hazırlık Çözüm hazırlık Hücre kültür ortamı için orta HeLa hücre kültürü için 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyerek 500 mL Dulbecco’nın modifiye kartal orta (DMEM) için hazır olun.Not: Antibiyotik hücre kültür ortamına eklenebilir, ancak biz antibiyotik kullanmayın. %0,1 paraformaldehyde için 1 %4 (w/v) paraformaldehyde erimesi x Phosphate-Buffered serum fizyolojik (%0,1 (v/v) paraformaldehyde 30 mL 1 x PBS ekleyerek yapmak için PBS) I…

Representative Results

Hücre döngüsü S veya M aşamasında HeLa hücreleri tutuklamaya işleminin şematik Resim 1′ de gösterilen. M faz tutuklandı bir örnek, açıkça (şekil 2A) mikroskop altında yuvarlak şekilli hücreler görselleştirebilirsiniz. Hücre döngüsü tutuklama verimliliğini incelemeye, nükleer hücre içeriğini FACS (şekil 2B) kullanılarak analiz edilebilir. Şekil 3 D7F7 antikor immunoprecipitate PKR üstün y…

Discussion

S veya M faz tutuklandı örnekleri hazırlamak için işlem şekil 1‘ de gösterilmiştir. S aşamada hücreleri tutuklamaya biz nereye biz timidin sürümüyle arasında yüksek tutuklama verimliliği (şekil 1A) sağlamak için iki kez bir 9 h hücrelerle tedavi timidin çift blok yöntemi kullanılır. M faz durması için biz timidin bir kez hücrelerle tedavi 9 h yayın tarafından takip ve nocodazole prometafaz (şekil 1B) bl…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Kore hükümeti Bilim Bakanlığı ve ICT (NMK-2016R1C1B2009886) tarafından desteklenen NMK) tarafından desteklenmiştir.

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
1 M Tris, pH 7.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1 M Tris, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1.7 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40) Biosolution BN015
10% Urea-acrylamide gel solution 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C
10X DNA loading buffer TaKaRa 9157
15 mL conical tube SPL 50015
3' adaptor 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5 Thermo Fisher Scientific AM9740
5' adaptor 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaCl Thermo Fisher Scientific AM9760G
50 mL conical tube SPL 50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5 Thermo Fisher Scientific AM9722
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphatase New England Biolabs M0289S
Anti-DGCR8 Made in house
Anti-PKR (D7F7) Cell signaling technology 12297S
Anti-PKR (Milli) Millipore EMD 07-151
ATP (100 mM) GE Healthcare GE27-2056-01
Bromophenol blue sodium salt Sigma-aldrich B5525
Calf intestinal alkaline phosphatase TaKaRa 2250A
Cell scraper 25 cm 2-position Sarstedt 83.183
CMV promoter sequence 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle medium Welgene LM001-05
dNTP mixture (2.5 mM) TaKaRa 4030
Ethanol, Absolute, ACS Grade Alfa-Aesar A9951
Fetal bovine serum Merck M-TMS-013-BKR
Formamide Merck 104008
Glycine Bio-basic GB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) Thermo Fisher Scientific AM9516
Isopropanol Merck 8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion Kit New England Biolabs E6318 rRNA Depletion Kit
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Normal rabbit IgG Cell signaling technology 2729S
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 6148
PCR forward primer (RP1) 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI) 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mL Axygen PCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) Tablet TaKaRa T9181
Phusion high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530 High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor Benchmark c2000
Polynucleotide kinase (PNK) TaKaRa 2021A
Protease inhibitor cocktail set III Merck 535140-1MLCN
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma-Aldrich 3115879001
qPCR primer sequence: CO1 Heavy Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 Light Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Light Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Heavy Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Light Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Heavy Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Light Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDH Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Light Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Light Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Light Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Light Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamer Thermo Fisher Scientific SO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) TaKaRa 2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) TaKaRa 2313A
Ribo-Zero rRNA Removal Kit Illumina MRZH116 rRNA Removal Kit
Rotator FINEPCR, ROTATOR AG D1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube Bio Plas 4167SLS50
Sodium dedecyl sulfate Biosesang S1010
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
SUPERase In Rnase inhibitor Thermo Fisher Scientific AM2694
SuperScript III reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18080093 Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18090010 Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stain Thermo Fisher Scientific S11494
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373
Thermomixer Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
Thymidine Sigma-Aldrich T9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE) TaKara T9122
Triton X-100 Promega H5142
Ultralink Protein A sepharose beads Thermo Fisher Scientific 22810 Protein A beads
Ultrasonicator Bioruptor
Urea Bio-basic UB0148
Vortex mixer DAIHAN Scientific VM-10
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) PerkinElmer BLU502A100UC

参考文献

  1. Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
  2. Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
  3. Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
  4. Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
  5. Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
  6. Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
  7. Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
  8. Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection – Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
  9. Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
  10. Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer’s disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
  11. Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer’s disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
  12. Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington’s disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
  13. Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
  14. Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
  15. Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
  16. Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
  17. Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
  18. Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
  19. Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
  20. Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
  21. Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
  22. Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
  23. Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
  24. Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3′ UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
  25. Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
  26. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  27. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  28. Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
  29. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  30. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  31. Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
  32. Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).

Play Video

記事を引用
Kim, S., Kang, M., Kim, Y. Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle. J. Vis. Exp. (145), e59215, doi:10.3791/59215 (2019).

View Video