Nós apresentamos abordagens experimentais para estudar RNA-interactianos de double-stranded RNA ligação proteína quinase RNA-ativado (PKR) durante o ciclo de pilha mamífero usando células HeLa. Este método utiliza o formaldeído para complexos de crosslink RNA-PKR e imunoprecipitação para enriquecer RNAs ligados a PKR. Estes RNAs podem ser analisados ainda mais através de sequenciamento de alto rendimento ou qRT-PCR.
Proteína quinase RNA-ativado (PKR) é um membro das proteínas de resposta imune inata e reconhece a estrutura secundária de double-stranded do RNA viral. Quando vinculado a viral double-stranded RNA (dsRNAs), o PKR sofre de dimerização e autofosforilação subsequente. PKR fosforilada (pPKR) torna-se ativo e induz a fosforilação de subunidade alfa do fator de iniciação eucariótico 2 (eIF2α) para suprimir a tradução global. Aumentando a evidência sugere que a PKR pode ser ativada em condições fisiológicas, tais como durante o ciclo celular ou sob diferentes condições de estresse, sem infecção. No entanto, nosso entendimento sobre os ativadores de RNA de PKR é limitado devido à falta de um método experimental padronizado para capturar e analisar dsRNAs PKR-interagindo. Aqui, apresentamos um experimental protocolo especificamente enriquecer e analisar PKR limite RNAs durante o ciclo celular utilizando células HeLa. Nós utilizamos a atividade de reticulação eficiente de formaldeído para corrigir complexos PKR-RNA e isolá-los através da imunoprecipitação. Então, PKR co-immunoprecipitated RNAs podem ser processados para gerar uma biblioteca de sequenciamento de alto rendimento ainda mais. Uma classe importante de PKR-interagindo celular dsRNAs é RNAs mitocondriais (mtRNAs), que podem existir como intermoleculares dsRNAs através da interacção complementar entre os RNAs de luz-fio e pesados-strand. Para estudar o strandedness destes mtRNAs frente e verso, apresentamos também um protocolo para a vertente específica qRT-PCR. Nosso protocolo é otimizado para a análise de RNAs PKR-limite, mas ele pode ser facilmente modificado para estudar dsRNAs celular ou RNA-interactianos de outras proteínas com ligação dsRNA.
Proteína quinase RNA-ativado (PKR), também conhecido como eucarióticas iniciação fator alfa-2 da quinase 2 (EIF2AK2), é uma bem caracterizadas proteína quinase que transmite informações fornecidas por RNAs. Pertence a alfa de subunidade de iniciação 2 Tradução eucariota (eIF2α) família quinase e fosforila eIF2α em serina 51 em resposta à infecção para suprimir a tradução global1. Neste contexto, o PKR é ativado por RNAs virais double-stranded (dsRNAs), que fornecem uma plataforma para PKR dimerização e autofosforilação2. Além de eIF2α, PKR pode também phosphorylate p53, substrato do receptor de insulina 1, inibidor κB e c-Jun N-terminal kinase (JNK) para regular a atividade de numerosos sinal transdução vias3,4,5, 6.
PKR foi originalmente identificada como uma quinase que fosforilado eIF2α durante a infecção de poliovírus através do reconhecimento dsRNAs7,8 dos poliovírus. PKR é encontrado cada vez mais a desempenhar papéis multifacetadas além da resposta imune, e sua ativação aberrante ou avaria está implícito em várias doenças humanas. Ativado/Phosphorylated PKR (pPKR) é frequentemente observada durante a apoptose e é uma característica comum dos pacientes do doenças degenerativas, particularmente doenças neurodegenerativas, como a doença de Huntington, Parkinson e a doença de Alzheimer9 ,10,11,12,13. Além disso, o PKR é ativado sob várias condições de estresse, tais como estresse metabólico e calor choque14,15,16,17. Por outro lado, a inibição da PKR resulta na proliferação celular aumentada e transformação maligna mesmo18,19. PKR função também é importante na função cerebral normal e durante o ciclo celular, como o nível de pPKR é elevada durante a fase de M20,21,22. Neste contexto, pPKR suprime tradução global e fornece dicas para sistemas de sinalização mitóticas chaves que são necessárias para a adequada divisão celular20. Além disso, a ativação prolongada de PKR resultou na fase G2/M detenção do ciclo celular em ovário de hamster chinês células23. Consequentemente, a fosforilação de PKR é regulada pelo ciclo de feedback negativo para garantir rápida desativação durante a transição de M/G121.
Apesar da função de ampla gama de PKR, nossa compreensão da ativação PKR é limitado devido à falta de uma abordagem experimental padronizada de alta produtividade para capturar e identificar dsRNAs que pode ativar PKR. Estudos anteriores mostraram que a PKR pode interagir com dsRNAs formado por dois invertido Alu repetições (IRAlus)20,24, mas a possibilidade da existência de dsRNAs celular adicional que pode ativar PKR durante o ciclo celular ou sob condições de estresse em células humanas era inexplorado. A abordagem convencional na identificação de RNA-interactianos de uma proteína de ligação de RNA (RBP) usa a luz UV para crosslink RNA-RBP complexos25,26,27. Um estudo recente aplicado esta abordagem de reticulação UV em um sistema de rato e identificou que pequenos RNAs nucleolares podem regular a ativação PKR durante o estresse metabólico16. Utilizando a reticulação de alta eficiência de formaldeído, apresentamos um método alternativo para identificar RNAs PKR-interagindo durante o ciclo celular em células de HeLa28. Uma abordagem similar foi aplicada para estudar outros dsRBPs como Staufen e Drosha29,30,31. Nós achamos que a PKR pode interagir com vários tipos de RNA não-codificante tais como curto interspersed nuclear elemento (SINE), longo intercaladas elemento nuclear (linha), elemento de retrovírus endógenos (ERV) e alfa-satélite nem RNAs. Além disso, mostramos que a PKR pode interagir com RNAs mitocondriais (mtRNAs), que forma intermoleculares dsRNAs através da interacção complementar entre a luz e pesados-strand strand RNAs28. Uma recente publicação mais suporte para nossos dados que algumas mtRNAs existe em um formulário frente e verso e pode ativar sensores dsRNA como melanoma diferenciação-proteína associada 5 para induzir os interferões32. Mais importante, a expressão e Localização subcellular das mtRNAs são modulados durante o ciclo celular e por vários factores de stress, que pode ser importante na sua capacidade de regular a ativação de PKR28.
Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para uma reticulação de formaldeído recentemente desenvolvidos e imunoprecipitação (fCLIP) método para capturar e analisar RNAs PKR-interagindo durante o ciclo celular. Demonstramos o método para preparar amostras de detenção do ciclo celular utilizando timidina e nocodazole. Em seguida apresentamos o processo de fCLIP para isolar RNAs ligados a PKR e um método para preparar a biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para identificar estes RNAs. Além disso, podemos delinear procedimentos detalhados para analisar ligados a PKR RNAs usando qRT-PCR. Especificamente, apresentamos um procedimento de transcrição reversa vertente específica para analisar o strandedness de mtRNAs. O protocolo descrito é otimizado para as células HeLa e PKR, mas etapas-chave tais como a preparação da amostra de ciclo celular, fCLIP e análise da vertente específica qRT-PCR podem ser facilmente modificadas para estudar celular dsRNAs ou identificar interactianos de RNA de outros dsRBPs.
O processo para preparar amostras de fase-preso S ou M é ilustrado na Figura 1. Para prender as células na fase S, usamos um método de bloqueio duplo de timidina onde tratamos as células com timidina duas vezes com um lançamento de 9h entre elas para assegurar a prisão de alta eficiência (figura 1A). Para a detenção de fase M, tratamos as células uma vez com timidina seguido por um lançamento de 9 h e então aplicado nocodazole ao bloco de células em…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo governo coreano, Ministério da ciência e TIC (NRF-2016R1C1B2009886).
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
Anti-DGCR8 | Made in house | ||
Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
Formamide | Merck | 104008 | |
Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
Triton X-100 | Promega | H5142 | |
Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
Ultrasonicator | Bioruptor | ||
Urea | Bio-basic | UB0148 | |
Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |