概要

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

Published: March 05, 2019
doi:

概要

우리는 HeLa 세포를 사용 하 여 포유류 세포 주기 동안 이중 가닥 RNA 바인딩 단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR)의 공부 RNA-인터에 대 한 실험적인 접근을 제시. 이 방법은 포름알데히드 crosslink RNA PKR 단지 및 PKR 바인딩된 RNAs를 풍부 하 게 하는 immunoprecipitation를 사용 합니다. 이러한 RNAs는 더 높은 처리량 시퀀싱 또는 qRT-PCR을 통해 분석할 수 있습니다.

Abstract

단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR) 타고 난 면역 반응 단백질의 회원 이며, 바이러스 성 RNAs의 더블-좌초 이차 구조를 인식 합니다. 때 바이러스 이중 가닥 RNAs (dsRNAs)에 바인딩된, PKR는 이합체 화 및 후속 autophosphorylation를 겪 습. Phosphorylated PKR (pPKR) 활성화 되 고 진 핵 개시 요인 2 (eIF2α) 글로벌 번역 억제의 알파 소 단위의 인 산화를 유도 한다. PKR 세포 주기 동안과 같은 생리 적인 조건 하에서 또는 감염 없이 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 될 수 있다 제안 증거를 증가. 그러나, PKR의 RNA 활성 제에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 상호 작용 분석 표준화 된 실험 방법의 부족으로 인해 제한 됩니다. 여기, 우리는 실험 현재 구체적으로 풍부 하 고 PKR 분석 프로토콜 바인딩된 RNAs HeLa 세포를 사용 하 여 세포 주기 동안. 우리는 PKR RNA 복합물을 수정 하 고 immunoprecipitation를 통해 그들을 격리 포름알데히드의 효율적인 가교 활동을 활용 합니다. PKR 공동 immunoprecipitated RNAs 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 생성 하기 위해 추가 처리 수 다음. 세포질 dsRNAs PKR 상호 작용의 1 개의 주요 클래스는 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 무거운 가닥 빛 가닥 RNAs는 보완 상호작용을 통해 intermolecular dsRNAs 존재할 수 있습니다. 공부 하 고 이러한 이중 mtRNAs의 strandedness, 또한 선물이 가닥 특정 qRT-PCR를 위한 프로토콜. PKR 바인딩된 RNAs의 분석을 위해 우리의 프로토콜 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 또는 다른 dsRNA 바인딩 단백질의 RNA 인터 공부를 쉽게 수정할 수 있습니다.

Introduction

단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR), 일컬어 진 핵 개시 요인 2 알파 니 2 (EIF2AK2), RNAs에 의해 제공 된 정보를 전송 하는 특징이 잘 단백질 키 니 아가입니다. 그것은 진 핵 번역 개시 2 소 단위 알파 (eIF2α)에 속하는 키 가족 고 떠들고 51 글로벌 번역1을 억제 하는 감염에 대 한 응답에서에서 eIF2α phosphorylates. 이러한 맥락에서 PKR PKR 이합체 화 및 autophosphorylation2에 대 한 플랫폼을 제공 하는 바이러스 성 더블-좌초 RNAs (dsRNAs)에 의해 활성화 됩니다. EIF2α, 외 PKR 수 phosphorylate 또한 p53, 인슐린 수용 체 기질 1, 억제 물 κB, 및 c 6 월 N 맨끝 키 니 아 제 (설립) 수많은 신호 변환 통로3,,45의 활동을 규제 하 6.

PKR 원래 소아마비의 dsRNAs7,8를 인식 하 여 소아마비 감염 시 eIF2α phosphorylated 키로 확인 되었다. PKR은 점점 면역 반응을 넘어 다각적인 역할을 발견 하 고 그것의 탈 선 활성화 또는 오작동 수많은 인간의 질병에서 함축 된다. 활성화/Phosphorylated PKR (pPKR) 자주 apoptosis 동안 관찰 하 고 퇴행 성 질환, 헌팅턴의 같은 특히 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병의, 그리고 알 츠 하이 머 병9 환자의 일반적인 특성은 ,,1011,,1213. 또한, PKR 대사 스트레스와 열 충격14,15,,1617등 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 됩니다. 다른 한편으로, PKR의 금지 증가 세포 증식에도 악성 변환18,19결과입니다. PKR 함수는 또한 정상적인 뇌 기능에 중요 한 이며 pPKR의 수준으로 세포 주기 동안 높은 M 단계20,,2122동안. 이러한 맥락에서 pPKR와 글로벌 번역을 억제 키 mitotic 신호 시스템에 적절 한 세포 분열20에 필요한 단서를 제공 합니다. 또한, PKR의 장기간된 활성화 G2/M 단계에 중국 햄스터 난소 세포 주기 검거 세포23에서 결과. 따라서, PKR 인 산화는 M/g 1 전환21동안 빠른 비활성화 되도록 부정적인 피드백 루프에 의해 통제 된다.

PKR의 넓은 범위 기능에도 불구 하 고 PKR 활성화에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 활성화할 수 있는 식별 표준화 높은 처리량 실험적인 접근의 부족으로 인해 제한 됩니다. 이전 학문은 보여주었다 PKR dsRNAs 두 거꾸로 Alu 반복 (IRAlus)20,24, 그러나 세포 주기 동안 또는 PKR을 활성화할 수 있는 추가 셀룰러 dsRNAs의 존재의 가능성에 의해 형성 된와 상호 작용할 수 있습니다. 인간 세포에 스트레스 조건 탐험 되지 않았습니다. RNA-인터 RNA 의무적인 단백질 (RBP)의 식별에 기존의 접근 crosslink RNA RBP 단지25,,2627에 UV 빛을 사용 합니다. 최근 연구 마우스 시스템에 자외선 가교 이렇게 적용 하 고 확인 작은 nucleolar RNAs 대사 스트레스16동안 PKR 활성화를 조절할 수 있습니다. 활용 하 여 포름알데히드의 높은 가교 효율, 우리는 HeLa 세포28에서 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 식별 하는 대체 방법 제시. 비슷한 접근 방식은 공부 스타 우 펜 및 Drosha29,,3031같은 다른 dsRBPs에 적용 되었습니다. 우리와 같은 짧은 산재 된 핵 성분 (사인), 긴 interspersed 핵 요소 (선), 내 인 성 레트로 바이러스 요소 (ERV), 그리고 심지어 알파 위성 RNAs PKR noncoding RNAs의 다양 한 종류 상호 작용 수 있습니다 발견. 또한, 우리는 PKR 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 어떤 양식을 intermolecular dsRNAs 무거운 물가 빛 사이의 상호 보완 작용을 통해 물가 RNAs28와 상호 작용할 수 있습니다 보였다. 최근 간행물은 더 일부 mtRNAs 이중 형태로 존재 하 고 흑색 종 분화 관련 단백질 5 interferons32유도 등 dsRNA 센서를 활성화할 수 있습니다 우리의 데이터 지원. 더 중요 한 것은, 식 및 mtRNAs의 subcellular 지 방화는 변조와 다양 한 스트레스에 의해 세포 주기 동안는 PKR 활성화28을 조절 하는 기능에 중요 한 있을 수 있습니다.

이 문서에서는 최근에 개발 된 포름알데히드 가교 및 immunoprecipitation (fCLIP)에 대 한 자세한 프로토콜 소개 캡처 및 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 분석 하는 방법. 티 미 딘 및 nocodazole를 사용 하 여 세포 주기 검거 샘플을 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 다음 PKR 바인딩된 RNAs 및 방법 이러한 RNAs를 식별 하기 위해 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 준비 하 분리 fCLIP 프로세스를 제시. 또한, 우리는 PKR 바인딩된 RNAs qRT-PCR를 사용 하 여 분석 하는 자세한 절차를 나타냅니다. 특히, 우리는 mtRNAs의 strandedness를 분석 하는 물가 관련 반전 녹음 방송 절차 제시. 설명된 프로토콜은 HeLa 세포 및 PKR, 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 공부 하거나 다른 dsRBPs의 RNA 인터 식별 키 단계의 세포 주기 샘플, fCLIP, 및 물가 관련 qRT-PCR 분석 준비 쉽게 수정할 수 있습니다.

Protocol

1. 솔루션 및 세포 준비 솔루션 준비 세포 배양에 대 한 준비 매체 헬러 세포 배양에 대 한 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL를 추가 하 여 500 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의.참고: 항생제는 세포 배양에 추가 될 수 있지만 우리는 항생제를 사용 하지 않습니다. 0.1 %paraformaldehyde 대 1에서 4% (w/v) paraformaldehyde 분해 x Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 난방 및 희석 뜨거운 접시에 1 x PBS를 추가 …

Representative Results

HeLa 세포의 세포 주기 S 또는 M 단계에서 체포 하는 과정에 대 한 개략도 그림 1에 표시 됩니다. M 단계 체포 샘플, 우리 명확 하 게 둥근 모양의 세포 (그림 2A) 현미경을 시각화할 수 있습니다. 세포 주기 검거의 효율성 검토, FACS (그림 2B)를 사용 하 여 셀의 핵 콘텐츠를 분석 수 있습니다. 그림 3 은 D7F7 항 체 immunoprecipitate PKR?…

Discussion

S 또는 M 단계 체포 샘플을 준비 하는 과정은 그림 1에 나와 있습니다. S 단계에서 셀을 체포, 우리 어디 우리가 두 번 높은 체포 효율 (그림 1A)를 보장 하기 위해 사이 9 h 출시와 함께 티 미 딘과 세포 치료 티 미 딘 더블 블록 메서드를 사용 합니다. M 단계 체포, 우리 한번 티 미 딘과 세포 치료 9 h 릴리스 및 nocodazole prometaphase (그림 1B</strong…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 기본적인 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부 교육부의 과학 및 ICT (NRF-2016R1C1B2009886)에 의해 자금에 의해 지원 되었다.

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
1 M Tris, pH 7.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1 M Tris, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1.7 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40) Biosolution BN015
10% Urea-acrylamide gel solution 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C
10X DNA loading buffer TaKaRa 9157
15 mL conical tube SPL 50015
3' adaptor 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5 Thermo Fisher Scientific AM9740
5' adaptor 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaCl Thermo Fisher Scientific AM9760G
50 mL conical tube SPL 50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5 Thermo Fisher Scientific AM9722
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphatase New England Biolabs M0289S
Anti-DGCR8 Made in house
Anti-PKR (D7F7) Cell signaling technology 12297S
Anti-PKR (Milli) Millipore EMD 07-151
ATP (100 mM) GE Healthcare GE27-2056-01
Bromophenol blue sodium salt Sigma-aldrich B5525
Calf intestinal alkaline phosphatase TaKaRa 2250A
Cell scraper 25 cm 2-position Sarstedt 83.183
CMV promoter sequence 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle medium Welgene LM001-05
dNTP mixture (2.5 mM) TaKaRa 4030
Ethanol, Absolute, ACS Grade Alfa-Aesar A9951
Fetal bovine serum Merck M-TMS-013-BKR
Formamide Merck 104008
Glycine Bio-basic GB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) Thermo Fisher Scientific AM9516
Isopropanol Merck 8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion Kit New England Biolabs E6318 rRNA Depletion Kit
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Normal rabbit IgG Cell signaling technology 2729S
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 6148
PCR forward primer (RP1) 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI) 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mL Axygen PCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) Tablet TaKaRa T9181
Phusion high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530 High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor Benchmark c2000
Polynucleotide kinase (PNK) TaKaRa 2021A
Protease inhibitor cocktail set III Merck 535140-1MLCN
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma-Aldrich 3115879001
qPCR primer sequence: CO1 Heavy Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 Light Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Light Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Heavy Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Light Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Heavy Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Light Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDH Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Light Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Light Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Light Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Light Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamer Thermo Fisher Scientific SO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) TaKaRa 2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) TaKaRa 2313A
Ribo-Zero rRNA Removal Kit Illumina MRZH116 rRNA Removal Kit
Rotator FINEPCR, ROTATOR AG D1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube Bio Plas 4167SLS50
Sodium dedecyl sulfate Biosesang S1010
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
SUPERase In Rnase inhibitor Thermo Fisher Scientific AM2694
SuperScript III reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18080093 Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18090010 Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stain Thermo Fisher Scientific S11494
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373
Thermomixer Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
Thymidine Sigma-Aldrich T9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE) TaKara T9122
Triton X-100 Promega H5142
Ultralink Protein A sepharose beads Thermo Fisher Scientific 22810 Protein A beads
Ultrasonicator Bioruptor
Urea Bio-basic UB0148
Vortex mixer DAIHAN Scientific VM-10
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) PerkinElmer BLU502A100UC

参考文献

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記事を引用
Kim, S., Kang, M., Kim, Y. Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle. J. Vis. Exp. (145), e59215, doi:10.3791/59215 (2019).

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