Lo studio di RNA interattori della chinasi proteica RNA-attivato durante il ciclo cellulare dei mammiferi
概要
Vi presentiamo approcci sperimentali per studi interattori di RNA double-stranded RNA binding della chinasi di proteina RNA-attivato (PKR) durante il ciclo cellulare dei mammiferi utilizzando cellule HeLa. Questo metodo utilizza la formaldeide a crosslink RNA-PKR complessi e immunoprecipitazione per arricchire associato a PKR RNAs. Questi RNA possono essere ulteriormente analizzati mediante sequenziamento ad alte prestazioni o qRT-PCR.
Abstract
Protein chinasi attivata da RNA (PKR) è un membro della risposta immunitaria innata di proteine e riconosce la struttura secondaria del doppio filamento di RNA virale. Quando associato a virale RNA double-stranded (dsRNA), PKR subisce la dimerizzazione e successive autophosphorylation. PKR fosforilato (pPKR) diventa attivo e induce la fosforilazione della subunità alfa di fattore di iniziazione eucariotica 2 (eIF2α) per sopprimere traduzione globale. La prova aumentante suggerisce che PKR può essere attivato in condizioni fisiologiche, come durante il ciclo cellulare o in varie condizioni di stress senza infezione. Tuttavia, la nostra comprensione degli attivatori RNA di PKR è limitata a causa della mancanza di un metodo sperimentale standardizzata per acquisire e analizzare RNAds PKR-interazione. Qui, presentiamo un sperimentale protocollo specificamente arricchire e analizzare PKR associato RNAs durante il ciclo cellulare utilizzando cellule HeLa. Utilizziamo l’attività di reticolazione efficiente di formaldeide per risolvere complessi PKR-RNA e isolarli tramite immunoprecipitazione. PKR co-immunoprecipitate RNAs poi possono essere ulteriormente elaborati per generare una libreria di sequenziamento ad alte prestazioni. Una classe importante di PKR-interazione cellulare RNAds è RNA mitocondriale (mtRNAs), che può esistere come intermolecolari RNAds attraverso l’interazione complementare tra il pesante-strand e il RNAs luce-strand. Per studiare la strandedness di questi mtRNAs duplex, presentiamo anche un protocollo per la qRT-PCR strand-specific. Il nostro protocollo è ottimizzato per l’analisi di RNA associati a PKR, ma può essere facilmente modificato per studiare cellulare RNAds o RNA-interattori delle altre proteine che legano il dsRNA.
Introduction
Protein chinasi attivata da RNA (PKR), chinasi di iniziazione eucariotica noto anche come fattore 2-alfa 2 (EIF2AK2), è una chinasi di proteina ben caratterizzati che trasmette informazioni fornite da RNA. Appartiene all’alfa subunità iniziazione 2 traduzione negli eucarioti (eIF2α) famiglia delle chinasi fosforila eIF2α a serina 51 in risposta all’infezione di sopprimere traduzione globale1. In questo contesto, PKR è attivato da virale RNA double-stranded (dsRNA), che fornisce una piattaforma per PKR dimerizzazione e autophosphorylation2. Oltre a eIF2α, PKR anche può fosforilare p53, insulina recettore substrato 1, inibitore κB e c-Jun N-terminal kinase (JNK) di regolare l’attività di numerosi segnale trasduzione vie3,4,5, 6.
PKR è stata originariamente identificata come una chinasi che fosforilata eIF2α durante l’infezione del virus polio attraverso il riconoscimento RNAds7,8 dei virus polio. PKR è sempre trovato a giocare ruoli poliedrico oltre la risposta immunitaria, e la sua attivazione aberrante o malfunzionamento è implicato in numerose malattie umane. Attivato/Phosphorylated PKR (pPKR) è osservata frequentemente durante l’apoptosi ed è una caratteristica comune dei pazienti con di malattie degenerative, in particolare malattie neurodegenerative come il morbo di Huntington, morbo di Parkinson ed il morbo di Alzheimer di9 ,10,11,12,13. Inoltre, PKR è attivato in varie condizioni di stress come stress metabolico e calore shock14,15,16,17. D’altra parte, l’inibizione di PKR provoca aumento della proliferazione cellulare e trasformazione maligna anche18,19. Funzione PKR è importante anche nella funzione normale del cervello e durante il ciclo cellulare come il livello di pPKR è elevato durante la fase di M20,21,22. In questo contesto, pPKR sopprime traduzione globale e fornisce spunti per sistemi di segnalazione mitotic chiave necessari per la corretta divisione cellulare20. Inoltre, attivazione prolungata di PKR provocato dalla fase G2/M23celle di arresto del ciclo cellulare in ovaia cinese del criceto. Di conseguenza, la fosforilazione di PKR è regolata dal ciclo di feedback negativo per garantire la rapida disattivazione durante la transizione di G1/M21.
Nonostante la funzione di vasta gamma di PKR, la nostra comprensione dell’attivazione di PKR è limitata a causa della mancanza di un approccio sperimentale ad alta produttività standardizzato per catturare e identificare dsRNA che può attivare PKR. Precedenti studi hanno mostrato che PKR può interagire con RNAds formata da due invertito Alu ripetizioni (IRAlus)20,24, ma la possibilità dell’esistenza di ulteriori RNAds cellulare che può attivare PKR durante il ciclo cellulare o sotto condizioni di stress nelle cellule umane è stato esplorato. L’approccio convenzionale nell’identificare RNA-Interactiani di una proteina obbligatoria del RNA (RBP) utilizza la luce UV a crosslink RNA-RBP complessi25,26,27. Uno studio recente ha applicato questo approccio di reticolazione UV in un sistema di mouse e identificato che small nucleolar RNA può regolare l’attivazione di PKR durante lo sforzo metabolico16. Utilizzando la reticolazione ad alta efficienza di formaldeide, abbiamo presentato un metodo alternativo per identificare PKR-interacting RNA durante il ciclo cellulare di cellule HeLa28. Un approccio simile è stato applicato per studiare altri dsRBPs come Staufen e Drosha29,30,31. Abbiamo trovato che PKR può interagire con vari tipi di RNA non codificanti come breve elemento nucleare sparpagliato (SINE), lunga sparpagliato elemento nucleare (linea), elemento di retrovirus endogeno (ERV) e anche alfa-satellite RNAs. Inoltre, abbiamo mostrato che PKR può interagire con il RNA mitocondriale (mtRNAs), quale forma intermolecolari RNAds attraverso l’interazione complementare tra la luce e il pesante-strand filo RNAs28. Una recente pubblicazione supportata ulteriormente i nostri dati che alcuni mtRNAs esistere in una forma duplex e può attivare sensori di dsRNA come proteina di differenziazione-collegata del melanoma 5 per indurre gli interferoni32. Ancora più importante, l’espressione e la localizzazione subcellulare di mtRNAs sono modulati durante il ciclo cellulare e di vari fattori di stress, che può essere importante nella loro capacità di regolare l’attivazione di PKR28.
In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per una reticolazione formaldeide sviluppata di recente e immunoprecipitazione (fCLIP) metodo per acquisire e analizzare PKR-interacting RNA durante il ciclo cellulare. Dimostriamo il metodo per preparare campioni di arresto del ciclo cellulare usando timidina e nocodazole. Presentiamo quindi il processo di fCLIP per isolare associato a PKR RNAs e un metodo per preparare la biblioteca di sequenziamento ad alte prestazioni per identificare questi RNA. Inoltre, abbiamo delineare le procedure dettagliate per analizzare associato a PKR RNA mediante qRT-PCR. In particolare, presentiamo una procedura di trascrizione inversa strand-specifico per analizzare la strandedness di mtRNAs. Il protocollo descritto è ottimizzato per le cellule HeLa e PKR, ma passaggi chiave quali la preparazione del campione di ciclo cellulare, fCLIP e analisi specifiche del filo qRT-PCR possono essere facilmente modificati per studiare cellulare RNAds o per identificare gli interattori di RNA di altri dsRBPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il processo per preparare campioni di fase-arrestato S o M è illustrato nella Figura 1. Per arrestare le cellule in fase S, abbiamo usato un metodo di blocco doppio timidina dove abbiamo trattato le cellule con timidina due volte con un rilascio di 9 h in mezzo per garantire arresto ad alta efficienza (Figura 1A). Per arresto di fase M, abbiamo trattato le cellule una volta con timidina seguita da un rilascio di 9 h e poi applicato nocodazole alle cellule di bl…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal programma di base scienza ricerca attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal governo coreano Ministero delle scienze e TIC (NRF-2016R1C1B2009886).
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
参考文献
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