概要

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Published: March 05, 2019
doi:

概要

Wir präsentieren experimentelle Ansätze für Studium RNA-Interaktoren des doppelsträngige RNA-bindende Proteinkinase RNA aktiviert (PKR) während des Säugetier-Zelle Zyklus mit HeLa-Zellen. Diese Methode nutzt Formaldehyd Crosslink RNA-PKR-komplexe und Immunopräzipitation PKR-gebundenen RNAs zu bereichern. Diese RNAs können weiter durch Hochdurchsatz-Sequenzierung oder qRT-PCR analysiert werden.

Abstract

Proteinkinase RNA aktiviert (PKR) ist ein Mitglied der angeborenen Immunantwort Proteine und erkennt die doppelsträngige Sekundärstruktur des viralen RNAs. Wenn virale doppelsträngige RNA (DsRNAs) verpflichtet, PKR Dimerisierung und anschließende Autophosphorylation erfährt. Phosphorylierten PKR (pPKR) wird aktiviert und induziert Phosphorylierung von der alpha-Untereinheit eukaryotic Initiation Factor 2 (eIF2α), globale Übersetzung zu unterdrücken. Erhöhung der Beweis schlägt vor, dass PKR unter physiologischen Bedingungen wie z. B. während des Zellzyklus oder unter verschiedenen Stressbedingungen ohne Infektion aktiviert werden kann. Unser Verständnis von der RNA-Aktivatoren von PKR ist jedoch aufgrund des Fehlens einer standardisierten experimentellen Methode zu erfassen und analysieren von PKR-wechselwirkenden DsRNAs beschränkt. Hier präsentieren wir ein experimentelles Protokoll gezielt anreichern und analysieren PKR gebunden RNAs während des Zellzyklus mit HeLa-Zellen. Wir nutzen die effiziente Vernetzung Aktivität von Formaldehyd zu PKR-RNA-komplexe zu beheben und über Immunopräzipitation zu isolieren. PKR-co-Immunoprecipitated-RNAs können dann weiterverarbeitet werden, um eine Bibliothek von Hochdurchsatz-Sequenzierung zu generieren. Eine wichtige Klasse von zellulären DsRNAs PKR-Interaktion ist mitochondriale RNAs (MtRNAs), die als intermolekulare DsRNAs durch ergänzende Zusammenspiel von Heavy-Strang und die Licht-Strang-RNA bestehen können. Um die Strandedness der dieser duplex MtRNAs zu untersuchen, stellen wir Ihnen auch ein Protokoll für Strang-spezifische qRT-PCR. Unser Protokoll ist für die Analyse von PKR-gebundenen RNAs optimiert, aber es kann leicht geändert werden, um zelluläre DsRNAs oder RNA-Interaktoren des anderen DsRNA-bindende Proteine zu studieren.

Introduction

Proteinkinase RNA aktiviert (PKR), auch bekannt als eukaryotic Initiation Faktor 2-Alpha Kinase 2 (EIF2AK2), ist ein gut charakterisierten Proteinkinase, die Informationen von RNAs überträgt. Es gehört zu den eukaryotic Übersetzung Einleitung 2 Untereinheit Alpha (eIF2α) Kinase Familie und phosphorylates eIF2α bei Serin 51 in Reaktion auf eine Infektion, globale Übersetzung1zu unterdrücken. In diesem Zusammenhang ist PKR durch virale doppelsträngige RNA (DsRNAs), aktiviert, die eine Plattform für PKR Dimerisierung und Autophosphorylation2zur Verfügung zu stellen. Neben eIF2α kann PKR auch c-Jun N-Terminal Kinase (JNK), Tätigkeit von zahlreichen Signal Transduction Bahnen3,4,5, Regeln, p53, Insulin-Rezeptor Substrat 1 und Inhibitor κB phosphorylieren 6.

PKR wurde ursprünglich als eine Kinase identifiziert, die eIF2α während der Poliovirus-Infektion phosphoryliert, durch das Poliovirus’ DsRNAs7,8erkennen. PKR findet sich zunehmend vielfältigen Rollen über Immunantwort zu spielen und seine aberrante Aktivierung oder Störung wird in zahlreichen menschlichen Krankheiten impliziert. Aktiviert/Phosphorylated PKR (pPKR) ist häufig zu beobachten während der Apoptose und ist ein gemeinsames Merkmal von Patienten mit degenerativer Erkrankungen, vor allem neurodegenerativer Erkrankungen wie der Chorea Huntington, Parkinson und Alzheimer-Krankheit9 ,10,11,12,13. Darüber hinaus ist PKR unter verschiedenen Stressbedingungen wie metabolischer Stress und Hitze Schock14,15,16,17aktiviert. Auf der anderen Seite führt Hemmung der PKR erhöhten Zellproliferation und sogar maligne Transformation18,19. PKR-Funktion ist auch wichtig in der normalen Gehirnfunktion und während des Zellzyklus als das Niveau der pPKR ist während der M Phase20,21,22erhöht. In diesem Zusammenhang pPKR globale Übersetzung unterdrückt und bietet Hinweise zu wichtigen mitotischen Signalsysteme, die für die ordnungsgemäße Zellteilung20erforderlich sind. Darüber hinaus führte anhaltende Aktivierung von PKR G2/M-Phase Zellzyklus Festnahme in Chinese Hamster Eierstock23Zellen. Infolgedessen ist der Negative Feedback-Schleife zu gewährleisten schnelle Deaktivierung während M/G1 Übergang21PKR Phosphorylierung geregelt.

Trotz der breiten Palette von PKR-Funktion beschränkt sich unser Verständnis von PKR Aktivierung aufgrund des Fehlens eines standardisierten Hochdurchsatz-experimentellen Ansatzes zu erfassen und identifizieren von DsRNAs, die PKR aktivieren können. Frühere Studien haben gezeigt, dass PKR interagieren kann, mit DsRNAs gebildet durch zwei invertierten Alu Wiederholungen (IRAlus)20,24, sondern die Möglichkeit der Existenz von weiteren zellulären DsRNAs, die PKR während des Zellzyklus oder unter aktivieren können Stressbedingungen in menschlichen Zellen war unerforscht. Der konventionelle Ansatz bei der Identifizierung von RNA-Interaktoren des ein RNA-bindendes Protein (RBP) verwendet UV-Licht auf Crosslink RNA-RBP-komplexe25,26,27. Eine aktuelle Studie dieser UV-Vernetzung-Ansatz in einem Maus-System angewendet und festgestellt, dass die kleinen Nukleolus RNAs PKR Aktivierung während metabolischer Stress16regulieren können. Durch die Verwendung von hohen Vernetzungseffizienz von Formaldehyd, präsentierten wir eine andere Methode zum PKR-Interaktion RNAs während des Zellzyklus in HeLa Zellen28zu identifizieren. Ein ähnlicher Ansatz wurde angewandt, um andere DsRBPs wie Staufen und Drosha29,30,31zu studieren. Wir fanden, dass PKR mit verschiedenen Arten von nichtcodierender RNA interagieren kann, wie z. B. kurzes eingestreuten nuklearen Element (Sinus), lange nuklearen Element (Linie), Element endogene Retroviren (ERV) und sogar Alpha-Satelliten-RNAs durchsetzt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass PKR welche Form intermolekulare DsRNAs durch ergänzende Zusammenspiel der Heavy-Strang und das Licht RNAs28Strang mit mitochondrialen RNAs (MtRNAs), interagieren kann. Eine kürzlich erschienenen Publikation unterstützt weiter unsere Daten, dass einige MtRNAs gibt es in einer duplex Formulars und DsRNA Sensoren wie Melanom Differenzierung-assoziierten Protein 5 induzieren Interferone32aktivieren können. Noch wichtiger ist, sind Ausdruck und subzelluläre Lokalisation der MtRNAs moduliert während des Zellzyklus und durch verschiedene Stressoren, die möglicherweise wichtig in ihrer Fähigkeit, PKR Aktivierung28zu regulieren.

In diesem Artikel präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für eine neu entwickelte Formaldehyd Vernetzung und Immunopräzipitation (fCLIP) Methode zum erfassen und analysieren von PKR-Interaktion RNAs während des Zellzyklus. Wir zeigen die Methode zum Zellzyklus Festnahme Proben mit Thymidin und Nocodazole vorzubereiten. Dann präsentieren wir Ihnen den fCLIP Prozess um PKR-gebundenen RNAs und eine Methode zur Vorbereitung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliothek, um diese RNAs zu identifizieren zu isolieren. Darüber hinaus beschreiben wir detaillierte Verfahren zur PKR-gebundenen RNA mittels qRT-PCR Analyse. Insbesondere stellen wir ein Strang-spezifische reversen Transkription Verfahren um die Strandedness des MtRNAs zu analysieren. Das beschriebene Protokoll für HeLa-Zellen und PKR optimiert ist, aber wichtige Schritte wie die Vorbereitung des Zellzyklus Probe, fCLIP und Strang-spezifische qRT-PCR-Analyse können einfach geändert werden, um zelluläre DsRNAs studieren oder RNA Interaktoren des anderen DsRBPs identifizieren.

Protocol

1. Lösung und Handy Vorbereitung Vorbereitung der Lösung Das Zellkulturmedium Vorbereitung Medium für HeLa Zellkultur durch Zugabe von 50 mL der fetalen bovine Serum (FBS), 500 mL von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM).Hinweis: Antibiotika können das Zellkulturmedium hinzugefügt werden, aber wir verwenden keine Antibiotika. Die 0,1 % Paraformaldehyd, lösen sich in 4 % (w/V) Paraformaldehyd in 1 x Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (PBS) mit Heizung auf einer heißen Platte und …

Representative Results

Ein Schaltplan für den Prozess zu verhaften, HeLa-Zellen in der S oder M-Phase des Zellzyklus ist in Abbildung 1dargestellt. Für eine M-Phase verhaftet-Probe können wir eindeutig Runde geformte Zellen unter dem Mikroskop (Abbildung 2A) visualisieren. Um die Effizienz der Zellzyklus Festnahme zu untersuchen, kann die nukleare Inhalt der Zelle mit FACS (Abb. 2 b) analysiert werden. Abbildung 3 zeigt repräsentative Daten…

Discussion

Der Prozess, S oder M Phase verhaftet Proben vorzubereiten ist in Abbildung 1dargestellt. Um Zellen in der S-Phase zu verhaften, verwendeten wir eine Thymidin-Doppelblock-Methode wo wir behandelten Zellen mit Thymidin zweimal mit einem 9 h Release dazwischen zu hohen Verhaftung Effizienz (Abbildung 1A). Für M-Phase-Verhaftung, behandelten wir Zellen einmal mit Thymidin gefolgt von einem Release 9 h und dann Nocodazole auf Block-Zellen bei prometaphase (<strong …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert durch die koreanische Regierung Ministerium für Wissenschaft und IKT (NRF-2016R1C1B2009886) unterstützt.

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
1 M Tris, pH 7.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1 M Tris, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1.7 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40) Biosolution BN015
10% Urea-acrylamide gel solution 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C
10X DNA loading buffer TaKaRa 9157
15 mL conical tube SPL 50015
3' adaptor 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5 Thermo Fisher Scientific AM9740
5' adaptor 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaCl Thermo Fisher Scientific AM9760G
50 mL conical tube SPL 50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5 Thermo Fisher Scientific AM9722
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphatase New England Biolabs M0289S
Anti-DGCR8 Made in house
Anti-PKR (D7F7) Cell signaling technology 12297S
Anti-PKR (Milli) Millipore EMD 07-151
ATP (100 mM) GE Healthcare GE27-2056-01
Bromophenol blue sodium salt Sigma-aldrich B5525
Calf intestinal alkaline phosphatase TaKaRa 2250A
Cell scraper 25 cm 2-position Sarstedt 83.183
CMV promoter sequence 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle medium Welgene LM001-05
dNTP mixture (2.5 mM) TaKaRa 4030
Ethanol, Absolute, ACS Grade Alfa-Aesar A9951
Fetal bovine serum Merck M-TMS-013-BKR
Formamide Merck 104008
Glycine Bio-basic GB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) Thermo Fisher Scientific AM9516
Isopropanol Merck 8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion Kit New England Biolabs E6318 rRNA Depletion Kit
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Normal rabbit IgG Cell signaling technology 2729S
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 6148
PCR forward primer (RP1) 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI) 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mL Axygen PCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) Tablet TaKaRa T9181
Phusion high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530 High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor Benchmark c2000
Polynucleotide kinase (PNK) TaKaRa 2021A
Protease inhibitor cocktail set III Merck 535140-1MLCN
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma-Aldrich 3115879001
qPCR primer sequence: CO1 Heavy Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 Light Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Light Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Heavy Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Light Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Heavy Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Light Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDH Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Light Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Light Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Light Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Light Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamer Thermo Fisher Scientific SO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) TaKaRa 2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) TaKaRa 2313A
Ribo-Zero rRNA Removal Kit Illumina MRZH116 rRNA Removal Kit
Rotator FINEPCR, ROTATOR AG D1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube Bio Plas 4167SLS50
Sodium dedecyl sulfate Biosesang S1010
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
SUPERase In Rnase inhibitor Thermo Fisher Scientific AM2694
SuperScript III reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18080093 Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18090010 Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stain Thermo Fisher Scientific S11494
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373
Thermomixer Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
Thymidine Sigma-Aldrich T9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE) TaKara T9122
Triton X-100 Promega H5142
Ultralink Protein A sepharose beads Thermo Fisher Scientific 22810 Protein A beads
Ultrasonicator Bioruptor
Urea Bio-basic UB0148
Vortex mixer DAIHAN Scientific VM-10
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) PerkinElmer BLU502A100UC

参考文献

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記事を引用
Kim, S., Kang, M., Kim, Y. Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle. J. Vis. Exp. (145), e59215, doi:10.3791/59215 (2019).

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