单分子水平标记均匀性的全蛋白质定量
概要
在这里, 我们提出了一个协议, 以评估标签同质性的每个蛋白质物种在一个复杂的蛋白质样本在单分子水平。
Abstract
细胞蛋白质组的特征通常使用电泳检测, 其中细胞中的所有种类的蛋白质都没有专门标记为荧光染料, 并在分离后被光电探测器发现。单分子荧光成像可以提供超敏感的蛋白质检测, 其能力, 可视化个别荧光分子。然而, 这种强大的成像方法在电泳检测中的应用受到了阻碍, 因为缺乏表征蛋白质组中每个蛋白质物种荧光标记的同质性的方法。在这里, 我们开发了一种基于单分子荧光成像分析的蛋白质组标记均匀性的方法。在我们使用 HeLa 细胞样本进行测量时, 用至少一种染料标记的蛋白质的比例被确定为50% 至 90%, 支持单分子成像应用于敏感而精确的蛋白质组分析。
Introduction
蛋白质组分析, 旨在量化在细胞中表达的整个蛋白质分子集, 是目前的生物和医学研究中的一个有价值的方法。这种分析通常依靠质谱技术, 根据通过蛋白质电离产生的光谱1,2,3来识别蛋白质物种。蛋白质组分析的另一种方法是电泳, 包括聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)、毛细管电泳和二维凝胶电泳。这种方法依赖于分析细胞中所有蛋白质分子的非特异性荧光标记, 然后对每个蛋白质物种进行电泳分离、检测和定量。为了实现所需的非特异性蛋白质标记, 一种策略是使用荧光染料, 这些染料可以通过静电和疏水相互作用与蛋白质结合, 例如 coomassie blue 和 sypro-ruby4、5、6.另一种策略是对含有 n-羟基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺的染料使用共价标记, 后者可以通过初级胺和硫醇等常见残留物与蛋白质共价结合,8。
同时, 荧光检测的灵敏度是分析低丰度蛋白质和少量细胞的理想选择。单分子荧光成像是最敏感的方法之一, 允许检测个别荧光染料和标记的蛋白质在体外和体内9, 10,11,12, 13,14,15。应用这种成像方法的电泳为基础蛋白质组分析, 预计通过计数单个荧光标记的蛋白质, 可以实现高度敏感和定量的检测。然而, 目前仍不清楚荧光染料的标记是否在所有蛋白质分子中都足够均匀, 以及不同的蛋白质种类如何影响这种同质性 (图 1)。简单的散装溶液测量可用于获得荧光染料与称为 “耦合效率” 8 或 “标记效率”的蛋白质的摩尔比, 但这一特性并不提供有关标记之间的均匀性的信息。蛋白质分子。
在这里, 我们描述了一种检测方案, 以研究细胞中所有蛋白质物种的标记同质性 (图 2)16。该检测的两个关键步骤是蛋白质纯化和成像。在第一步中, 细胞中的所有蛋白质都是荧光标记和生物素化的, 然后使用凝胶电泳然后进行电洗法提取。第二步, 在单分子成像的基础上, 对提取样品中单个蛋白质分子的荧光特性进行评价。从这些数据来看, 重要的参数对计数分析很重要, 例如用最少一种染料标记的蛋白质的百分比, 我们称之为标记占用率 (LO) 16, 以及与单个蛋白质分子结合的荧光染料的平均数量 (n~ n染料), 可以被描述。在该协议中, 以 NHS 酯为基础的氰氨酸 3 (Cy3) 染料标记 H待体细胞蛋白质组的优化程序为例, 并可根据所需的研究目标使用其他标记程序进行修改。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了一种用 SDS-PAGE 分离后细胞中每个标记蛋白物种的标记同质性的量化方案 (步骤 3)。分离方法可替代其他方法, 如液相色谱或毛细管电泳, 允许分离和分馏的细胞蛋白与高分辨率, 同时需要特殊的设备23。例如, 在当前协议中使用 Nhs-ster 的标记方法可以用使用马来酰亚胺酯或抗体的其他方法取代。
标签均匀性分析的要求取决于标记在多大程度上偏离了…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢大野正和和屋的实验协助和建议。这项工作得到了 PRESTO (JPMJPR15F7)、日本科学技术厅、青年科学家补助金 (a) (24687022)、挑战探索性研究 (26650055) 和日本信息社会创新领域科学研究 (23115005) 的支持。促进科学, 并由武田科学基金会和莫奇达医学和药物研究纪念基金会提供赠款。S. l. 感谢 RIKEN 国际项目助理 (IPA) 计划的支持。
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
参考文献
- Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
