Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única
概要
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.
Abstract
Proteomas celulares se caracterizan a menudo usando análisis de electroforesis, donde todas las especies de proteínas en las células no específicamente están marcadas con un colorante fluorescente y son vistas por un fotodetector tras su separación. Imágenes de fluorescencia de una molécula pueden proporcionar detección ultrasensible de la proteína con su capacidad para la visualización de las moléculas fluorescentes individuales. Sin embargo, la aplicación de este método de proyección de imagen de gran alcance para ensayos de electroforesis es obstaculizada por la falta de formas de caracterizar la homogeneidad de las etiquetas fluorescentes de cada especie de proteína en el proteoma. Aquí, se desarrolló un método para evaluar la homogeneidad de etiquetado en el proteoma basado en un análisis de imágenes de fluorescencia de sola molécula. En nuestra medición en una muestra de células HeLa, la proporción de proteínas con al menos un tinte, que denomina ‘etiquetado ocupación’ (LO), se determinó al rango del 50% al 90%, apoyando el potencial de la aplicación de la proyección de imagen de una molécula a Análisis del proteoma sensible y precisa.
Introduction
Análisis del proteoma, que tiene como objetivo cuantificar el conjunto de moléculas de la proteína expresada en la célula, es un enfoque valioso en estudios biológicos y medicamentos actuales. Este análisis se basa comúnmente en espectrometría de masa, que identifica especies de proteínas basadas en espectros generados a través de proteínas ionización1,2,3. Un método alternativo para el análisis del proteoma es la electroforesis, incluyendo electroforesis de geles de poliacrilamida (PAGE) y electroforesis capilar, electroforesis en dos dimensiones (2D). Este método se basa en etiquetado fluorescente no específicos de todas las moléculas de proteína en las células analizadas, seguidas por separación electroforética y la detección y cuantificación de cada especie de proteína. Para lograr el etiquetado requiere proteína no específica, una estrategia es utilizar tintes fluorescentes que pueden unirse a proteínas a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas, tales como azul de Coomassie y Sypro Ruby4,5,6 . Una estrategia alternativa es usar etiquetado covalente con tintes que contengan éster N-hydroxysuccinimide (NHS) o maleimida, que puede unirse covalentemente a proteínas a través de residuos comunes tales como aminas primarias y tioles, respectivamente7, 8.
Mientras tanto, la sensibilidad de detección de fluorescencia es ideal para el análisis de proteínas de baja abundancia y al pequeño número de células. Imágenes de fluorescencia de una molécula es uno de los métodos más sensibles que permite la detección de tintes fluorescentes individuales y etiquetadas proteínas en vitro y en vivo9,10,11,12, 13,14,15. Se espera que la aplicación de este método de imagen para el análisis del proteoma basado en electroforesis permiten análisis altamente sensibles y cuantitativos por contar proteínas individuales marcada con fluorescencia. Sin embargo, no queda claro si etiquetado con tintes fluorescentes es bastante homogéneo en todas las moléculas de proteína, y cómo esta homogeneidad es afectada por especies diferentes de proteínas (figura 1). Simples medidas de solución a granel pueden utilizarse para obtener un cociente molar de tintes fluorescentes para proteínas llamadas ‘eficiencia de acoplamiento’8 o ‘etiquetado eficiencia’, pero esta propiedad no proporciona información sobre la homogeneidad de las etiquetas entre moléculas de la proteína.
Aquí, describimos el protocolo de un ensayo investigar la homogeneidad Etiquetadora para todas las especies de proteínas en la célula (figura 2)16. Los dos pasos claves de este ensayo son la proyección de imagen y purificación de proteínas. En el primer paso, todas las proteínas en las células llevan la etiqueta fluorescente y biotinilado, luego extraída por separado mediante electroforesis en gel seguido por electroelución. En el segundo paso, propiedades de fluorescencia de las moléculas individuales de proteínas en las muestras extraídas son evaluadas en base a proyección de imagen de molécula única. De estos datos, parámetros importantes para el análisis de la cuenta, tales como el porcentaje de proteínas etiquetados con uno menos tinte, que llamamos etiquetado ocupación (LO)16, y el número promedio de tintes fluorescentes enlazado a una molécula de proteína sola (n̄ tinte), se puede caracterizar. En el protocolo, un procedimiento optimizado para el etiquetado el proteoma de células HeLa con tinte de Cianina 3 (Cy3) basado en éster NHS se presenta como un ejemplo y puede modificarse con otros procedimientos de etiquetado según objetivos de investigación deseada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este papel describe un protocolo para cuantificar la homogeneidad Etiquetadora de cada especie de etiquetado de proteínas en las células después de la separación con SDS-PAGE (paso 3). El método de separación puede ser sustituido con otros métodos como la cromatografía líquida o electroforesis capilar, que permiten la separación y fraccionamiento de proteínas celulares con alta resolución, mientras que requieren equipo especial23. El método de etiquetado con NHS-ester en el protocolo …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Masae Ohno y Kazuya Nishimura para asesoramiento y asistencia experimental. Este trabajo fue apoyado por PRESTO (JPMJPR15F7), Japón Agencia de ciencia y tecnología, subvenciones para jóvenes científicos (A) (24687022), desafiando la investigación exploratoria (26650055) y la investigación científica en áreas innovadoras (23115005), sociedad japonesa para la promoción de la ciencia y por las subvenciones de la Fundación de ciencia de Takeda y el Mochida Memorial Foundation para la investigación farmacéutica y médica. S.L. reconoce apoyo del programa de RIKEN internacional programa asociado (IPA).
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
参考文献
- Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
