단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

프로테옴 분석, 셀에 표시 하는 단백질 분자의 전체 집합을 계량 하는 것을 목표로, 현재 생물의 약 연구에 귀중 한 접근 이다. 이 분석은 일반적으로 단백질 종 단백질 이온화^1,2,3를 통해 생성 된 스펙트럼에 따라 식별 하는 질량 분석에 의존 합니다. 프로테옴 분석에 대 한 대체 방법 이며 전기 이동 법, polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)를 포함 하 여, 모 세관 전기 이동 법 2 차원 (2D) 젤 전기 이동 법. 이 방법은 일반적인 전기 이동 별거 및 탐지 및 정량화 각 단백질의 분석 된 셀에서 모든 단백질 분자의 형광 라벨에 의존 합니다. 달성 하기 위해 필요한 일반적인 단백질 라벨, 하나의 전략 Coomassie Blue와 Sypro-루비^{4,5,6 등 정전기 및 소수 성 상호 작용을 통해 단백질을 바인딩할 수 있는 형광 염료를 사용 하는} . N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테 르 또는 maleimide, 1 차 아민 및 thiols와 같은 일반적인 잔류물을 통해 단백질에 묶는 covalently 수 있습니다, 각각^7, 를 포함 하는 염료와 화학식 라벨을 사용 하는 대체 전략은 ⁸.

한편, 형광 검출의 감도 낮은 풍부한 단백질 및 세포의 작은 숫자 분석에 이상적입니다. 단일 분자 형광 이미징 개별 형광 염료와 생체 외와 생체 조건^{9,10,,1112, 레이블이 지정 된 단백질의 검출을 허용 하는 가장 중요 한 방법 중 하나는 13,,1415}. 응용 프로그램 이미징이 방법의 전기 기반 프로테옴 분석을 개별 붙일 표시 된 단백질을 계산 하 여 매우 민감하고 양적 분석을 사용 예정입니다. 그러나, 남아 있다 불분명 여부 형광 염료로 충분히 균질에 걸쳐 모든 단백질 분자 이며 어떻게이 동질성 다른 단백질 종 (그림 1)에 의해 영향을 받습니다. 간단한 대량 솔루션 측정 ‘커플링 효율’⁸ 또는 ‘효율 라벨’ 라는 단백질에 형광 염료의 어 금 니 비율을 얻기 위해 사용할 수 있지만이 속성 중 라벨의 동질성에 정보를 제공 하지 않습니다. 단백질 분자입니다.

여기, 우리는 라벨 동질성¹⁶셀 (그림 2) 모든 단백질 종에 대 한 조사 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 분석 결과의 두 가지 주요 단계는 단백질 정화 및 이미징. 첫 번째 단계에서 셀에 모든 단백질은 붙일 표시 하 고 biotinylated, 다음 별도로 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 압축을 푼 뒤에 electroelution. 두 번째 단계에서 추출 된 표본에서 개별 단백질 분자의 형광 속성 단일 분자 이미징에 따라 평가 됩니다. 우리가 라벨 인 (LO)¹⁶, 전화와 형광 염료의 평균 수는 단일 단백질 분자에 바인딩된는이 데이터를 매개 변수 계산 분석에 대 한 중요 한 단백질의 비율 이라고 적어도 한 같은 염색 (n̄ _염료), 특성화 될 수 있습니다. 프로토콜, NHS 에스테 르 기반 Cyanine 3 (Cy3) 염료와 HeLa 세포 프로테옴을 라벨에 대 한 최적화 절차를 예를 들어, 제시 하 고 원하는 연구 목표에 따라 다른 레이블 프로시저를 수정할 수 있습니다.