Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola
概要
Qui, presentiamo un protocollo per valutare l’omogeneità d’etichettatura per ogni specie di proteine in un campione di proteina complessa a livello di singola molecola.
Abstract
Proteomi cellulari sono spesso caratterizzati utilizzando dosaggi di elettroforesi, dove tutte le specie delle proteine nelle cellule non specifico sono marcate con un colorante fluorescente e sono individuate da una cellula fotoelettrica dopo la loro separazione. Formazione immagine di fluorescenza di singola molecola può fornire rilevamento ultrasensibile della proteina con la sua capacità per la visualizzazione di singole molecole fluorescenti. Tuttavia, l’applicazione di questo potente metodo di imaging a saggi di elettroforesi è ostacolata dalla mancanza di modi per caratterizzare l’omogeneità dell’etichettatura fluorescente di ogni specie di proteine attraverso il proteoma. Qui, abbiamo sviluppato un metodo per valutare l’omogeneità d’etichettatura attraverso il proteoma basato su un’analisi di formazione immagine di fluorescenza singola molecola. Nella nostra misura utilizzando un campione di cellule HeLa, la proporzione di proteine etichettate con almeno un colorante, che abbiamo chiamato ‘etichettatura occupazione’ (LO), è stato determinato per gamma dal 50% al 90%, sostenere l’elevato potenziale dell’applicazione di imaging di singola molecola di analisi del proteoma sensibile e precisa.
Introduction
Analisi del proteoma, che mira a quantificare l’intero set di molecole di proteina espressa nella cella, è un valido approccio negli attuali studi biologici e medicinali. Questa analisi si basa comunemente sulla spettrometria di massa, che individua le specie di proteine basato su spettri generati attraverso proteine ionizzazione1,2,3. Un metodo alternativo per analisi del proteoma è l’elettroforesi, tra cui l’elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGE), elettroforesi capillare ed elettroforesi bidimensionale (2D). Questo metodo si basa sull’etichettatura fluorescente non specifici di tutte le molecole di proteina in cellule analizzate, seguite da separazione elettroforetica e la individuazione e la quantificazione di ogni specie di proteina. Per ottenere il contrassegno richiesta non specifico proteina, una strategia è quella di utilizzare tinture fluorescenti che possono legarsi a proteine tramite interazioni elettrostatiche e idrofobiche, come blu di Coomassie e Sypro Ruby4,5,6 . Una strategia alternativa consiste nell’utilizzare etichettatura covalente con coloranti contenenti N-Idrossisuccinimide (NHS) estere o maleimide, che può legare covalentemente alle proteine attraverso comuni residui come primarie ammine e tioli, rispettivamente7, 8.
Nel frattempo, la sensibilità di rilevazione della fluorescenza è ideale per l’analisi di basso-abbondanza proteine e un piccolo numero di cellule. Formazione immagine di fluorescenza di singola molecola è uno dei metodi più sensibili che permette la rilevazione dei singoli coloranti fluorescenti e con etichetta delle proteine in vitro e in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Applicazione di questo metodo di imaging per analisi del proteoma basati su elettroforesi è previsto per consentire analisi altamente sensibili e quantitative contando singole proteine fluorescente etichettati. Tuttavia, rimane poco chiaro se etichettatura con coloranti fluorescenti è abbastanza omogenea in tutte le molecole di proteina, e come questa omogeneità è influenzata da specie differenti della proteina (Figura 1). Rilievi relativi alla soluzione semplice massa possono essere utilizzati per ottenere un rapporto molare di coloranti fluorescenti per proteine chiamate ‘efficienza di accoppiamento’8 o ‘etichettatura efficienza’, ma questa proprietà non fornisce informazioni sull’omogeneità di etichettatura tra molecole di proteina.
Qui, descriviamo il protocollo per un’analisi per indagare l’omogeneità d’etichettatura per tutte le specie di proteine nella cellula (Figura 2)16. I due passaggi chiavi di questo test sono imaging e purificazione della proteina. Nel primo passaggio, tutte le proteine nelle cellule fluorescente sono etichettate e biotinilato, quindi estratta separatamente utilizzando l’elettroforesi del gel seguita da electroelution. Nel secondo passaggio, proprietà di fluorescenza di molecole singole proteine nei campioni estratti vengono valutate in base su formazione immagine singola molecola. Da questi dati, parametri importanti per l’analisi di conteggio, come la percentuale di proteine etichettate con un’almeno una tingono, che noi chiamiamo etichettatura occupazione (LO)16, e il numero medio di coloranti fluorescenti legati ad una molecola singola proteina (n̄ colorante), può essere caratterizzato. Nel protocollo, una procedura ottimizzata per l’etichettatura del proteoma delle cellule HeLa con tintura di cianina 3 (Cy3) a base di estere NHS è presentata come esempio e può essere modificata con altre procedure di etichettatura secondo obiettivi di ricerca desiderato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un protocollo per quantificare l’omogeneità d’etichettatura di ogni specie di proteina marcata nelle cellule dopo la separazione con SDS-PAGE (passaggio 3). Il metodo di separazione possa essere sostituito con altri metodi come la cromatografia liquida o elettroforesi capillare, che permettono la separazione e frazionamento delle proteine cellulari con alta risoluzione, mentre che richiedono attrezzature speciali23. Il metodo d’etichettatura utilizzando NHS-estere nel pro…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Masae Ohno e Kazuya Nishimura per consulenza e assistenza sperimentale. Questo lavoro è stato supportato da PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science and Technology Agency, localizzativi per giovani scienziati (A) (24687022), sfidando ricerca esplorativa (26650055) e ricerca scientifica in settori innovativi (23115005), Japan Society for la promozione della scienza e di sovvenzioni da parte della Takeda Science Foundation e la Fondazione Memorial Mochida per il medico e ricerca farmaceutica. S.L. riconosce sostegno dal programma RIKEN associare programma internazionale (IPA).
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
参考文献
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