Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.
Cel proteomes worden vaak gekenmerkt met behulp van elektroforese testen, waar alle soorten eiwitten in de cellen worden niet-specifiek aangeduid met een fluorescente kleurstof en zijn gespot door een foto-elektrische cel na hun scheiding. Enkel molecuul fluorescentie imaging kan voorzien haar vermogen voor het visualiseren van individuele fluorescerende moleculen ultrasensitive eiwit detectie. De toepassing van deze krachtige imaging methode voor elektroforese bepalingen wordt echter belemmerd door het gebrek aan manieren om de homogeniteit van het fluorescerende labeling van elke soort eiwit over de Proteoom karakteriseren. Hier, wij een methode ontwikkeld om de labeling homogeniteit het proteoom op basis van een enkel molecuul fluorescentie imaging assay evalueren. In onze meting met behulp van een steekproef van HeLa cel, het aandeel van eiwitten, aangeduid met ten minste één kleurstof, die we genoemd ‘labelen bezetting’ (LO), was vastbesloten om bereik van 50% tot 90%, ter ondersteuning van het grote potentieel van de toepassing van één molecuul imaging te gevoelige en nauwkeurige Proteoom-analyse.
Proteoom analyse, die is gericht op het kwantificeren van de hele set van eiwitmolecules uitgedrukt in de cel, is een waardevolle benadering in huidige biologische en medische studies. Deze analyse is vaak afhankelijk van de Spectrometrie van de massa, waarmee eiwit soorten op basis van spectra gegenereerd door eiwit ionisatie1,2,3. Een alternatieve methode voor proteoom-analyse is elektroforese, met inbegrip van polyacrylamide gelelektroforese (pagina), capillaire elektroforese en tweedimensionale (2D) gelelektroforese. Deze methode is afhankelijk van de aspecifieke fluorescerende etikettering van alle de eiwitmolecules in de geanalyseerde cellen, gevolgd door elektroforetische scheiding en opsporing en kwantificering van elke soort eiwit. Om te bereiken dat de vereiste aspecifieke eiwit labeling, is een strategie het gebruik van fluorescente kleurstoffen die aan eiwitten via elektrostatische en hydrofobe interacties, zoals Coomassie Blue en Sypro-Ruby4,5,6 binden kunnen . Een alternatieve strategie is het gebruik van covalente labelen met kleurstoffen met N-hydroxysuccinimide (NHS) ester- of maleimide, die covalent aan eiwitten door middel van gemeenschappelijke residuen zoals primaire amines en thiolen binden kan, respectievelijk7, 8.
Ondertussen, de gevoeligheid van de fluorescentie detectie is ideaal voor het analyseren van lage-overvloed eiwitten en kleine aantallen cellen. Enkel molecuul fluorescentie imaging is één van de meest gevoelige methodes waarmee de detectie van individuele fluorescente kleurstoffen en gelabelde proteïnen in vitro en in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Toepassing van deze beeldvorming methode elektroforese gebaseerde Proteoom analyse wordt verwacht om zeer gevoelige en kwantitatieve tests door het tellen van afzonderlijke fluorescently gelabelde proteïnen. Het blijft echter onduidelijk of labelen met fluorescente kleurstoffen is homogeen genoeg over alle de eiwitmolecules, en hoe deze homogeniteit wordt beïnvloed door verschillende eiwit soorten (Figuur 1). Eenvoudige bulk oplossing metingen kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van een molaire ratio van fluorescente kleurstoffen aan eiwitten ‘koppeling efficiëntie’8 of ‘labelen efficiëntie’ genoemd, maar deze eigenschap biedt geen informatie op de homogeniteit van de etikettering onder eiwitmolecules.
Hier beschrijven we het protocol voor een bepaling te onderzoeken de labeling homogeniteit voor alle soorten van de eiwitten in de cel (Figuur 2)16. De twee belangrijkste stappen van deze bepaling zijn EiwitReiniging en beeldvorming. In de eerste stap, alle van de eiwitten in de cellen worden fluorescently aangeduid en biotinyleerd, vervolgens uitgepakt afzonderlijk met behulp van gelelektroforese gevolgd door electroelution. In de tweede stap, worden fluorescentie-eigenschappen van individuele eiwitmolecules in de uitgepakte monsters geëvalueerd op basis van één molecuul imaging. Van deze gegevens, parameters die belangrijk zijn voor het tellen analyse, zoals het percentage eiwitten aangeduid met ten minste een kleurstof, die wij noemen labeling bezetting (LO)16, en het gemiddelde aantal fluorescente kleurstoffen gebonden aan een molecule één eiwit (n̄ kleurstof), kan worden gekarakteriseerd. In het protocol, een geoptimaliseerde procedure voor het labelen van de HeLa cel Proteoom met NHS ester gebaseerde Cyanine 3 (Cy3) kleurstof wordt gepresenteerd als een voorbeeld, en kan worden aangepast met andere labeling procedures volgens onderzoek van de gewenste doelstellingen.
Dit witboek beschrijft een protocol om te kwantificeren van de labeling homogeniteit van elke soort gelabelde proteïnen in cellen na scheiding met SDS-pagina (stap 3). De methode van scheiding kan met andere methoden, zoals vloeibare chromatografie of capillaire elektroforese, waarmee scheiding en versplintering van cellulaire eiwitten met een hoge resolutie, terwijl het vereisen van speciale apparatuur23worden vervangen. De labeling methode met behulp van NHS-ester in het huidige protocol kan wo…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken Masae Ohno en Kazuya Nishimura voor experimentele hulp en advies. Dit werk werd gesteund door PRESTO (JPMJPR15F7), Japan-Science and Technology Agency, Grants-in-aid voor jonge wetenschappers (A) (24687022), uitdagende verkennend onderzoek (26650055) en wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (23115005), Japan Society for de bevordering van wetenschap, en door subsidies van de Takeda Science Foundation en de Mochida Memorial Foundation voor medische en farmaceutische Research. S.L. erkent ondersteuning vanuit de RIKEN International-programma koppelen (IPA) programma.
22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
Borate | Nacalai-tesque | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
DMEM | Sigma-Aldrich | ||
DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
EDC | Nacalai-tesque | ||
EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
SDS | Wako | NC0792960 | |
Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |