真核硼酸背液转运体的表达、增溶及纯化

1. 介质和重要缓冲器的制备 加入200克又直的水和去离子水, 使总体积达到500毫升, 制备500毫升的40% 半乳糖。使用热板或微波炉来增加半乳糖进入溶液的速度。带真空过滤装置的无菌过滤器, 由连接在无菌玻璃瓶上的0.2μm 过滤器顶部组成。注: 所有介质溶液均使用去离子水制备。 在500毫升的总体积中加入200克葡萄糖和水, 制备500毫升的40% 葡萄糖。灭菌用高压灭菌器。 在四个 2 l 瓶中的每一个, 加入 0.4 g 的完整补充混合物, 不含组氨酸 (csm-hs), 3.35 克酵母氮碱与硫酸铵 (ynb + 氮), 和475毫升水。高压 釜。加入25毫升的40% 葡萄糖, 最终达到2% 的葡萄糖浓度。 加入玻璃瓶, 50 克肽和25克酵母提取物和水到375毫升。高压 釜。加入125毫升的40% 半乳糖, 给出5x 酵母肽 (yp) 溶液, 其中含有10% 半乳糖。 加入250毫升的烧瓶, 0.04 克 csm-hs, 0.04 g ynb + 氮气, 并将水添加到 47.5 ml。高压 釜。加入2.5 毫升的40% 葡萄糖, 得到50毫升的 CSM-His + ynb + 2% 的葡萄糖。 将 121.14 g 的 tris 碱与800毫升的水混合, 制备 1M tris ph 7.0 的1升。加入浓缩的盐酸, 直到 ph 值达到7.0。将水加入1升的最终体积, 并通过0.2μm 的过滤器。 将 73.06 g edta 与400毫升水混合, 制备 500 ml 0.5 m 乙二胺四乙酸 (edta) ph 值8.0。加入氢氧化钠颗粒, 直到 edta 溶解, ph 值达到8.0。将水加入到500毫升的最终体积中, 并通过0.2μm 的过滤器。 将1.74 克的 pmsf 与200乙醇混合, 制备 100 mm 苯甲磺酰氟化物 (pmsf) 100 毫升。储存在-20°c。 准备225毫升的2x 珠洗缓冲液, 包括 50 mm tris ph 7.0、1.4 m 氯化钠、20% 甘油和 1 mm edta ph 8.0。 制备100毫升大小排除色谱缓冲液 (s200 缓冲液), 包括 20 mL 4-莫诺林诺-乙酰磺酸水合物 (mes) ph 值 6.5, 100 mL 氯化碳, 2% 甘油, 和0.03% 正十二烷基β–d-麦芽苷 (ddm)。 制备100毫升膜再悬浮液, 包括 50 mm tris ph 7.0、500 mm nacl 和10% 甘油。 通过混合3毫升20% 十二烷基硫酸钠 (sds)、3毫升甘油、2.4 ml 1m tris ph 6.8、0.03 克溴酚蓝和 1.6 ml 2-硫醇, 制备 3x sds-page 负载染料的10毫升。 2. 硼酸盐转运体在酿酒酵母中的过度表达 在 csm-hs + ynb + 2% 葡萄糖培养基的50毫升中接种三个转化酵母菌落, 并在30°c 下的 190 rpm 下过夜。 第二天使用分光光度计确定波长为 600 nm (od600) 的光学密度, 并接种到每个包含500毫升 csm-her + ynb + 2% 葡萄糖介质的四个 2 l 瓶中每个0.01 的 od 600. 在30°c 下以190转/分的速度晃动 30小时, 使细胞消耗所有葡萄糖并生长到高密度。注: 更长的生长时间会导致更大的细胞产量, 更大的收获膜产量, 并最终更大的纯化蛋白质产量。 通过添加125毫升的 5x yp 介质, 辅以10% 半乳糖, 最终诱导浓度为2% 半乳糖, 从而产生表达。在30°c 下以190转/分的速度晃动16小时。 收获细胞, 以 4, 000 x g 的速度旋转 15分钟, 在100毫升冷水中重新移植细胞。注: 此时细胞可能会在-80°c 无限期冷冻, 或者准备可能会继续进入细胞裂解和膜采集。我们通常收获40-45 克的细胞。 3. 酵母膜的采收 加入 1m tris ph 7.0 的细胞再悬浮液 11.25 ml, 0.5 m edta 的 0.45 ml 和 100 mm pmsf 的 2.25 ml, 后者作为蛋白酶抑制剂。将水添加到225毫升的最终体积中, 从而产生 50 mm tris ph 7.0、1 mm edta 和 1 mm pmsf 的细胞再悬浮缓冲液。注: 如果使用冷冻细胞使细胞在室温下彻底解冻, 约 1小时, 因为如果它们保持部分冷冻, 他们将通过珠子跳动抵抗裂解。 将细胞重新悬浮到450毫升的金属罐中, 进行珠子跳动。顶部关闭剩余的体积与冷0.5 毫米玻璃珠。 与转子组装一个珠拍打室, 沉浸在冰浴中。执行6分钟脉冲, 间隔2分钟休息时间, 以防止裂解液过热。 通过使用塑料一次性瓶装顶部过滤器将真空过滤装置组装成玻璃瓶。取下滤膜, 因为剩余的塑料装置可以捕捉珠子, 同时允许裂解液通过。在应用真空的同时, 将珠子跳动室的内装物浇注到组件上, 将珠子从裂解液中分离出来。 用225ml 的2x 洗涤缓冲液清洗珠子殴打室, 其中包含 50 mm tris ph 7.0、1 mm edta、1 mm pmsf、1.4 m nacl 和20% 甘油。将房间里的东西倒在珠子上清洗。注: 洗涤给出了 ~ 450 毫升裂解细胞的最终体积, 并显著提高了收获的膜产量。最终浓度为 50 mm tris ph 7.0、1 mm edta、1 mm pmsf、10% 甘油和 700 mm nacl, 提高盐浓度的主要目的是帮助分离外周膜蛋白。 在 15, 000 x g 的情况下, 将细胞裂解液向下旋转15分钟。将上清液倒入聚碳酸酯瓶中, 在 135, 000 x克的超离心机中旋转 1小时, 以收集膜。注: 如果没有超离心机, 可通过在 53, 000 x克的情况下旋转3小时来收集膜, 这种力可以在地板模型离心机中实现。 丢弃上清液, 用膜颗粒称重瓶子。将膜颗粒在含有 50 mm tris ph 7.0、500 mm nacl 和10% 甘油的约 35 ml 膜再悬浮液中, 并添加到玻璃保镖中。称量空离心管, 以确定所收获的膜的质量。注: 在有效的膜收获中, 膜的重量将等于用于该膜收获的细胞重量的大约20%。该协议给出了 40-45 g 的典型电池产量, 因此我们同样期望 8-9 g 的细胞产量。 将膜和脂肪读入50毫升的锥形管中, 现在可以无限期地储存在-80°c。注: 在这个实验中, 通常会制作两个等价物, 以便从一个原始细胞制剂中进行两个单独的蛋白质纯化。 4. 蛋白质的溶解和纯化 在烧杯上添加一个搅拌棒和150毫克的正十二烷基β-d-maltopyranoside (ddm) 每克膜使用。在任何时候都要将蛋白质保存在冰上或4°c。注: ddm 是吸湿性的, 不使用时应存放在干燥的玻璃瓶中, 使其在-20°c 时具有干燥剂。此外, 它是典型的使用4-5 克之间的膜在纯化, 以获得相当数量的纯蛋白质。 解冻膜, 并在膜再悬浮缓冲液中达到每克膜15毫升的最终体积, 辅以 1 mm 的 pmsf 和 20 mm 的咪唑 ph 8.0。在烧杯上加入 ddm, 在4°c 下搅拌1小时。注: ddm 浓度为 1% wv, 但对于膜蛋白的增溶, 更重要的是要知道每克膜添加洗涤剂的质量。 在 135, 000 x克的4°c 下旋转 25分钟, 以颗粒非溶解性材料。通过5μm 注射器过滤器过滤上清液。 通过蠕动泵将样品加载到 1 mlmin 的流速上, 使其达到 1 ml 固定化镍合柱, 平衡在 20 mm tris ph 值7.0、500 mm nacl、10% 甘油、20 mm 咪唑 ph 值8.0 和 0.05% ddm 中平衡。注: 对于表达较低的蛋白质, 使用 1 ml 而不是 5 ml 柱和镍而不是钴离子进行亲和层析观察到了更高的纯度和产量。 用含有 20 mm tris ph 值7.0、500 mm nacl、10% 甘油、80 mm 咪唑 ph 8.0 和 0.05% ddm 的洗涤缓冲液的10柱清洗。注: 在清洗10-g 标记的蛋白质时, 可以使用咪唑浓度高于人们通常所认识的浓度, 从而提高纯度。 在含有 20 mm tris ph 值7.0、200 mm nacl、10% 甘油、300 mm 咪唑 ph 值8.0 和 0.05% ddm 的缓冲液中清除蛋白质。收集洗脱液在 10 1 毫升的分数, 并运行在4-20 的三甘氨酸 sds-page 凝胶与溶解性裂解液和洗涤分数。 池峰值分数, 通常约为5-6 毫升, 并在台式离心机在4°c 冷藏的 50 kda 截止集中器中浓缩到500μl 或更小体积。注: 500μl 是典型的最大体积注入到大小排除色谱 (sec) 列。此时, 蛋白质可以在-80°c 无限期地储存或继续储存到 sec。 通过0.2μm 自旋柱过滤器过滤蛋白质, 注入到大小排除柱 (例如, superdex-200) 中平衡 s200 缓冲液:20 mm mes ph 值 6.5, 100 mm nacl, 2% 甘油和 0.03% ddm。注: 对于随后的戊二醛交联试验, 缓冲剂不得含有原胺。证交会是一个在必要时交换缓冲区的机会, 就像在这里把 tris 换成 mes 时所做的那样。 在4-20 的公路甘氨酸 sds-page 凝胶上运行峰值分数。在4°c 下, 在 50 kDa-cutoff 的集中器中, 涂上凝胶, 收集纯峰值分数。 通过测量波长为280纳米的吸收率来确定蛋白质浓度, 并在-80°c 无限期地储存。 5. 戊二醛交联检测 在 s200 缓冲液中混合 3μl 0.5 mg/ml 蛋白, 在 s200 缓冲液中混合 5μl, 将其中任何一种水的1μl 或20% 的十二烷基硫酸钠 (sds), 然后是1.5% 戊二醛的 1μl, 从而制备10μl 反应。注: 这将使一个1x 反应 0.15 mgml 蛋白和0.15 戊二醛。含有 sds 预处理的样品是重要的阴性对照, 在加入戊二醛之前, 应在室温下混合孵育5分钟。 在室温下将反应孵化30分钟。通过添加5μl 的3xsds-page 凝胶加载染料来终止反应, 该染料含有过量的 tris 缓冲液, 可抑制戊二醛。 将所有15μl 加载到4-20 的 ris-甘辛 sds-page 凝胶上, 该凝胶将在每条车道上加载1.5 微克蛋白质。在 200 v 的温度下运行凝胶 30分钟, 并通过有证据确定二聚体交联的程度, 该波段的运行大小是变性单体的两倍。注: 谷氨醛滴定法和时间过程可以先进行, 以找到最佳条件的同功转运体。