Выражение, солюбилизация и очистки эукариотических Борат транспортеров

1. подготовка средств массовой информации и важных буферов Подготовка 500 мл 40% галактозы, добавив 200 г галактозы и деионизированной воды до общего объема 500 мл. Используйте плита или Микроволновая печь для увеличения скорости галактозы, попадая в раствор. Стерильные фильтр с вакуумной фильтрации аппарат, состоящий из верхней фильтр 0.2 мкм, придает стерильной стеклянной бутылке.Примечание: Все решения СМИ готовятся с использованием деионизированной водой. Подготовка 500 мл 40% раствор глюкозы, добавив 200 г глюкозы и воды до общего объема 500 мл. Автоклав для стерилизации. В каждой из четырех колбы 2 Л добавьте 0,4 г полное дополнение смеси без гистидина (CSM-его), 3.35 г дрожжей азота с сульфата аммония (YNB + азота) и 475 мл воды. Автоклав. Добавьте 25 мл 40% глюкозы для достижения окончательного глюкозы 2%. Добавить в стеклянной бутылке, 50 г Пептон и 25 г дрожжей экстракт и воды до 375 мл. Автоклав. Добавьте 125 мл 40% галактозы дают 5 x дрожжи Пептон (YP) раствор, содержащий 10% галактозы. Добавить, чтобы флакон 250 мл, 0,04 г CSM-его, 0,335 g YNB + азота и воды до 47.5 мл. Автоклав. Добавьте 2.5 мл 40% раствор глюкозы получить 50 мл CSM-его YNB + 2% раствор глюкозы. Подготовка 1 Л 1 М трис pH 7.0 путем смешивания 121.14 g Tris база с 800 мл воды. Добавление концентрированной соляной кислоты до pH 7.0. Добавьте воду в окончательный объем 1 Л и пройти через фильтр 0.2 мкм. Подготовка 500 мл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) рН 8.0 путем смешивания 73.06 g ЭДТА с 400 мл воды. Добавьте гидроксида натрия гранулы, до тех пор, пока ЭДТА не распущена, и достигает рН 8,0. Добавьте воду в окончательный объем 500 мл и пройти через фильтр 0.2 мкм. Подготовка 100 мл 100 мм phenylmethanesulfonyl фтора (PMSF) путем смешивания 1,74 g PMSF с 200 доказательство этанола. Хранить при температуре от-20 ° C. Подготовьте 225 мл 2 x шарик мыть буфера, состоящий из 50 мм трис pH 7.0, 1,4 М NaCl, 20% глицерина и 1 мм ЭДТА рН 8.0. Подготовка 100 мл размер буфера исключения хроматографии (S200 буфера), состоящий из 20 мм 4-Morpholinoethanesulfonic кислота гидрат (MES) pH 6.5, 100 мм NaCl, 2% глицерина и 0,03% н додецил бета D-Maltopyranoside (DDM). Подготовка 100 мл буфера ресуспендирования мембрана, состоящая из 50 мм трис pH 7.0, 500 мм NaCl и 10% глицерина. Подготовка 10 мл 3 x SDS-PAGE загрузки краситель, смешивая 3 мл 20% натрия Додециловый сульфат (SDS), 3 мл глицерина, 2,4 мл 1 М трис рН 6,8, 0,03 g бромфеноловый синий и 1,6 мл 2-меркаптоэтанол. 2. гиперэкспрессия Борат транспортер в S. cerevisiae Прививать три преобразованные дрожжи колоний в 50 мл CSM-его + YNB + 2% глюкозы СМИ и трясти ночлег в 190 об/мин при 30 ° C. Следующий день использовать спектрофотометр для определения оптической плотности на длине волны 600 Нм (600ОД) и прививать ОД600 0,01 четыре 2 L колбы, каждый из которых содержит 500 мл CSM-его YNB + 2% глюкозы СМИ. Погрозит 190 об/мин при 30 ° C за 30 h разрешить клетки, чтобы потреблять все глюкозы и расти до высокой плотности.Примечание: Длительное время роста результатов в более крупных клеток дает, больше собранного мембраны урожайности, и дает в конечном итоге больше очищенный протеин. Побудить выражение путем добавления 125 мл 5 x YP СМИ, дополнена галактозы 10% для окончательного индукции концентрации 2% галактозы. Погрозит 190 об/мин при 30 ° C для 16 h. Урожай клетки, спиннинг на 4000 x g 15 мин Ресуспензируйте клетки в 100 мл холодной воды.Примечание: на данном этапе клетки могут быть заморожены при температуре-80 ° C на неопределенный срок, или prep может продолжаться в лизис клеток и мембран уборки. Мы обычно урожай 40-45 g клеток. 3. Сбор дрожжей мембран Добавьте в ячейку ресуспендирования 11,25 1 М трис рН 7.0, 0,45 мл 0,5 М ЭДТА до 2,25 мл 100 мм PMSF, последний, два из которых действуют как ингибиторы протеазы. Добавьте воду в окончательный объем 225 мл, что приводит в буфере ресуспендирования ячейки 50 Tris pH 7.0, 1 мм ЭДТА и 1 мм PMSF.Примечание: Если с использованием замороженных клетки позволяют клеткам оттепель тщательно, около 1 ч при комнатной температуре, потому что если они частично заморожены, они будут лизису путем избиения шарик. Добавьте ячейку ресуспендирования в жестяную баночку 450 мл для бисера избиение. Довершение оставшийся объем с холодной 0,5 мм бисер. Соберите шарик избиение камеры с ротором и погружать в ванну льда. Выполняют шесть импульсов 1 мин, разделенных 2 мин отдыха для предотвращения перегрева lysate. Соберите Аппарат вакуумной фильтрации, используя пластиковые одноразовые бутылки Топ фильтр пьяный в стеклянной бутылке. Удаление Фильтрующая мембрана, потому что остальные пластиковые устройство может захватить бисер позволяя lysate пройти. Отделите бисер от lysate, выливая содержимое камеры избиение шарик на Ассамблее при применении вакуум. Вымойте зале избиение шарик с 225 мл 2 x мыть буфер, содержащий 50 мм трис pH 7.0, 1 мм ЭДТА, 1 PMSF, 1.4 М NaCl и 20% глицерина. Вылейте содержимое камеры на бусы, чтобы вымыть их.Примечание: Мыть дает конечный объем ~ 450 мл лизированы клеток и значительно увеличивает заготовленной мембраны дает. Окончательный концентрации 50 мм трис pH 7.0, 1 мм ЭДТА, 1 PMSF, 10% глицерина и 700 мм NaCl, и основная цель повышения концентрации соли помочь отделить периферийных мембранных белков. Спин вниз ячейки lysate 15 мин на 15000 x g. Залейте супернатант в поликарбонатные бутыли и спина на 1 ч в 135000 x g в ультрацентрифуга собирать мембраны.Примечание: Если не доступен ультрацентрифуги, мембраны могут быть собраны спиннинг для 3 h на 53000 x g, силой, что достижимо в полу модели центрифуги. Отменить супернатант и весят бутылки с гранулами мембраны. Ресуспензируйте мембраны окатышей в приблизительно 35 мл мембраны ресуспендирования буфер, содержащий 50 мм трис pH 7.0, 500 мм NaCl и 10% глицерина и добавить в стакан douncer. Вес пустого пробирок для определения массы мембран собирают.Примечание: В эффективную мембрану урожая, вес мембраны будет равен примерно 20% веса клеток используется для этого мембрана урожая. Этот протокол дает типичных клеток урожайности 40-45 g, и таким образом мы также ожидаем, что доходность 8-9 g мембран. Dounce гомогенизировать мембраны и Алиготе в 50 мл конические трубы, которые теперь могут храниться бессрочно-80 ° c.Примечание: Для этого эксперимента, обычно два аликвоты сделаны, чтобы разрешить два отдельных белка очищения выполняться из одного оригинального подготовка клетки. 4. солюбилизация и очистки белков В стакан добавьте перемешать бар и 150 мг n додецил β-D-Maltopyranoside (DDM) в g мембраны используются. Держите белка на льду или на 4 ° C на все времена.Примечание: DDM гигроскопичен и следует хранить в стеклянной банке с осушителем при-20 ° C, когда не в пользе. Кроме того это типичный для использования между 4-5 g мембран в очищение получить достаточное количество чистого белка. Оттепель мембраны и довести до окончательного объема 15 мл на g мембраны мембраны ресуспендирования буфера с 1 мм PMSF и 20 мм имидазола pH 8.0. Добавить стакан с DDM мембраны и размешать 1 ч при 4 ° C.Примечание: Концентрация DDM будет 1% w/v, но для солюбилизация мембранных белков это более важно быть в курсе массы моющих средств, добавил на g мембраны. Спина на 25 мин на 135 000 x g при 4 ° C для пеллет-солюбилизирован материал. Через шприц фильтр 5 мкм фильтр супернатант. Достижение равновесного уровня нагрузки, образец перистальтического насоса присвоено значение скорости потока 1 мл/мин на столбец сходства иммобилизованных никель 1 мл в 20 мм трис рН 7,0, 500 мм NaCl, 10% глицерина, 20 мм имидазола рН 8,0 и 0,05% DDM.Примечание: Нижняя выражая белков, улучшение чистоты и урожаи были замечены с помощью 1 мл вместо 5 мл столбец и никель вместо ионов кобальта для аффинной хроматографии. Промойте колонку с 10 томов столбец мыть буфера, содержащего 20 мм трис рН 7,0, 500 мм NaCl, 10% глицерина, 80 мм имидазола рН 8,0 и 0,05% DDM.Примечание: Концентрация имидазола, который может использоваться во время мойки для 10-его тегами белка выше, чем обычно ценится и приводит к улучшению чистоты. Элюировать белка в буфер, содержащий 20 мм трис рН 7,0, 200 мм NaCl, 10% глицерина, 300 мм имидазола рН 8,0 и 0,05% DDM. Собирать элюата в десяти 1 мл фракций и на геле трис глицин SDS-PAGE 4-20% вместе с растворимых lysate и мыть фракциях. Бассейн пик фракций, обычно около 5-6 мл и сосредоточиться на 500 мкл или меньше объем в 50 kDa отсечки концентратор в настольная центрифуга, в холодильнике при температуре 4 ° C.Примечание: 500 мкл это типичный максимальный объем, вводят в размер исключения хроматографии (SEC) столбцов. На этом этапе белка может храниться бессрочно-80 ° c или продолжить на SEC. Через фильтр столбцов спин 0.2 мкм фильтр белка и вставляют на размер исключения столбца (например, Superdex-200) достижение равновесного уровня в буфере S200: 20 мм Mes рН 6,5, 100 мм NaCl, 2% глицерина и 0,03% DDM.Примечание: Для последующих глютаральдегид, cross-linking пробирного, буферизации агент не должен содержать Первичные амины. СЕК-это возможность обменяться буферов, при необходимости, как это сделано здесь при обмене трис для МЧС. Запуск Пик фракций на трис глицин SDS-PAGE 4-20% гель. Пятно гель, собирать чисто пик фракций и сосредоточиться в 50 концентратор кДа отсечки при 4 ° C. Определить концентрацию протеина путем измерения поглощение на длине волны 280 Нм и хранить бессрочно в-80 ° C. 5. глютаральдегид, Cross-linking Assay Подготовка 10 мкл реакции путем смешивания 3 мкл белка 0.5 мг/мл в буфере S200, 5 мкл буфера S200, 1 мкл воды или 20% лаурилсульфат натрия (SDS), следуют 1 мкл глютаральдегид 1,5%.Примечание: Это даст 1 x реакции белков и 0,15% глютаральдегид 0,15 мг/мл. Образцы, содержащие Предварительная обработка SDS важные негативный контроль и должен быть смешиваются и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут перед добавлением глютаральдегид. Инкубируйте реакции на 30 минут при комнатной температуре. Прекратить реакции, добавив 5мкл 3 x загрузки краситель, который содержит избыток трис-буфер, который утоляет глютаральдегид геля SDS-PAGE. Загрузите все 15 мкл на гель трис глицин SDS-PAGE 4-20%, который будет загружать 1,5 мкг белка на пер. Побегите гель на 200 V для 30 min. пятно и определить степень димер cross-linking доказательств Группа, которая работает в два раза размер денатурированного мономера.Примечание: Глутаровый титрования и времени курс может выполняться в первую очередь найти лучшие условия для homomeric транспортер.