Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de proteção do sujeito humano WRAIR. Amostras utilizadas neste estudo são amostras de soro humano coletadas como parte do número do protocolo do WRAIR 1328, em conformidade com todas as regulamentações federais e institucionais que regem a proteção de assuntos humanos. As amostras foram identificadas de, e o uso destas amostras anônimo foi classificado como não-humanos sujeito pesquisa pela UAB IRB (número de protocolo N150115001). 1. preparar os reagentes do ensaio Prepare-se 1% gelatina pela adição de 1 g de gelatina para 100 mL de água. Autoclave e armazenar à temperatura ambiente. Prepare 100 mg/mL solução stock de TTC (cloreto de 2,3,5-Triphenyltetrazolium) (1, 000 x) pela adição de 5 g de TTC para 40 mL de água. Quando o TTC é totalmente dissolvido, ajuste o volume para 50 mL com água e filtro estéril usando filtro de 0,2 µm. Armazenar a solução a 4 ° C e proteger da luz.Nota: TTC colore as colônias bacterianas e torna-los mais fácil de contar. Solução TTC tem uma ligeira cor amarela. Se solução TTC desenvolve uma cor vermelha, descartar e prepare-se fresco. Prepare a solução de estoque (100 x) (NaN3) azida de sódio de 10% pela adição de 5 g de NaN3 a 40 mL de água. Após dissolução completa, adicione água a 50 mL. Armazenar em temperatura ambiente.Atenção: Azida de sódio é um veneno e pode ser tóxica se ingerido ou absorvido através da pele ou olhos. Ele pode reagir com chumbo ou cobre para formar azidas metálicas altamente explosivas. Na eliminação dos reagentes contendo azida sódica, lave com um grande volume de água para evitar a acumulação de azidas ou descartar em um saco de risco biológico. Prepare a placa LBA (placa de ágar LB) pela adição de 35 g de ágar-ágar LB para 1 L de água e autoclave. Adicione 25 mL de cada placa de Petri quadrada (120 x 120 mm2). Incube placas em RT para 10-20 min para permitir que o ágar solidificar. Colocar placas em sacos de plástico e loja a 4 ° C por até 1 mês. Prepare ágar Overlay adicionando 7,5 g de ágar-ágar a 1.000 mL de água e autoclave. Incube em banho de água de 56 ° C até ser necessário. Bem antes de usar, adicione 1 mL de 100mg/mL TTC e 10 mL de 10% NaN3 e misture bem.Nota: Cada placa LBA precisa de 25 mL de ágar Overlay. Gelose pode ser preparado até para um mês de antecedência e derretido no microondas ou em uma chapa quente conforme necessário para o ensaio. Certifique-se de que a temperatura de ágar-ágar é ~ 55 ° C antes da aplicação para placas LBA. Prepare o Buffer de ensaio, adicionando 5 mL de 10 x Hanks equilibrado sal solução (HBSS) com Ca2 +/ mg2 + e 5 mL de 1% de gelatina para 40 mL de água. Armazenar em temperatura ambiente. 2. prepare o complemento e bactérias-alvo Prepare o coelho bebê complemento (BRC)Nota: Detalhada de critérios para seleção de monte de complemento pode ser encontrada aqui: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf Obter BRC congelado e descongele com água corrente fria. Fisicamente, misturar o BRC cada ~ 10-20 min até completamente derretido. Não exponha o BRC a ciclos de descongelamento repetidos congelamento. Enquanto o BRC é descongelar, rotule tubos de centrífuga de 1,5 mL, 5mL ou 15 mL. Lugar rotulado tubos no gelo para pre-cool. Volume adequado alíquota BRC para os tubos de centrífuga pre-cooled (após o enchimento, imediatamente retornar cada tubo de gelo). Loja alíquotas a ≤-70 ° C no congelador.Nota: Aproximadamente 1 m do complemento é necessária para cada placa de ensaio. Alíquotas de complemento são para uso único e devem ser aliquotadas em volumes adequados a ensaiar layouts de. Para preparar o BRC inactivados por calor, descongele uma alíquota de ativo BRC. Prepare um banho de água de 56 ° C. Depois BRC é completamente derretido, transferi-lo para o banho de água e incube por 30 min. Após a incubação, remover BRC inactivadas pelo calor do banho e deixar arrefecer no RT de 10-15 min.. Misture vigorosamente e alíquota µ l ~ 150 para tubos de 1,5 mL microcentrifuge. Armazenar as alíquotas a ≤-10 ° C. Preparar o alvo estoque de bactériasNota: O procedimento a seguir é usado para preparar 48 alíquotas de estoque de bactérias do alvo; Se forem necessários mais alíquotas o protocolo pode ser ampliado. Remova as bactérias estoque mestre frasco do congelador e raspe a superfície bacteriana congelada para remover uma pequena quantidade de gelo do frasco em uma placa de ágar sangue. Volte imediatamente o frasco de estoque mestre para o congelador. Marcam esta pequena alíquota do estoque bacteriana para a placa de ágar sangue e cubra com a tampa da placa. Incube a placa de cabeça para baixo durante a noite em 37 °C/5% CO2 incubadora. Transferência de ~ 10 colónias lisas isoladas para um tubo de 50 mL contendo 30 mL de caldo LB. Incube durante 3-5 h a 37 ° C, com agitação suave até que o caldo de cultura tem uma OD600 de ~0.6-0,7. Colheita do topo 12,5 mL da cultura e da transferência de um tubo 50 mL. Centrifugar a cultura a 15.000 x g por 2 min usando uma microcentrífuga de mesa. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 25 mL de glicerol estéril de 15%-LB. Misture bem e dispense alíquotas de 0,5 mL em tubos de centrífuga micro estéril 1,5 mL (~ 48 tubos). Loja alíquotas a ≤-70 ° C no congelador. Confirme a identidade bacteriana utilizando o teste de aglutinação antes do uso. Determinação do factor de diluição ideal para o estoque de bactérias do alvoNota: Cada lote de estoque de bactérias alvo deve ser titulado em condições de ensaio para determinar a diluição necessária para produzir ~ 120 CFU/spot em placas LB. Obter uma placa de microtitulação (placa de diluição) e adicione 135 µ l de Buffer de ensaio para bem a 1A. Adicione 120 µ l de manteiga de ensaio para poços 1B – 1H. Retire um frasco de bactérias alvo congelado do freezer e descongelar à temperatura ambiente. Adicione 15 UL de ações bacterianas descongelada para bem 1A para fazer uma diluição de 10 vezes das ações bacterianas. Transferi 30 µ l de solução bacteriana de bem 1A a 1B bem para realizar uma diluição serial 5-fold. Continue 5-fold diluições em série para bem 1h para um total de 8 diluições (01:10 01:50 1: 250; 1:250 1; 1:250 6; 1:250 31; 1:250 156; 1:781 250). Pegar outra placa de microtitulação (placa de ensaio) e adicionar 20 µ l de Buffer de ensaio para tudo bem nas colunas 1 e 2 na placa de ensaio. Transferi 10 µ l de bactérias diluídas de cada poço na coluna 1 da placa de diluição para os poços correspondentes nas colunas 1 e 2 da placa de ensaio. 10 µ l de bactérias é transferido do bem 1A da placa de diluição para bem 1A e 2A no ensaio de placa, etc. Continue com o ensaio conforme descrito no ensaio bactericida soro (SBA) abaixo para controle A e B do controle, passos 3.6-3.12. Depois que as placas têm sido incubadas no gelo, use uma pipeta multicanal com 8 pontas de pipetas para detectar 10 µ l dos poços na coluna 1 em um prato LBA. Também, identificar os poços da coluna 2 na placa de LBA. Continue com o ensaio conforme descrito a seguir em passos 3.14-4.6. Determine a diluição de bactérias que produz ~ 120 que CFU/spot no controle B, esta diluição será usado no ensaio. 3. soro ensaio bactericida (SBA) Nota: O procedimento descrito abaixo é para uma placa de ensaio, mas o número de placas de ensaio pode ser aumentado. Calor-inativar testar amostras pela incubação de amostras em um banho de água de 56 ° C durante 30 min.Nota: Amostras de teste devem ser inactivadas pelo calor antes do teste para revogar qualquer atividade complementar endógena. Isso pode ser feito antes do ensaio e amostras inactivadas podem ser re-congeladas ou armazenadas a 4 ° C até testado. Uma placa de ensaio e adicionar 20 µ l de Buffer de ensaio para colunas de 1 a 12 de linhas A através de G. Adicionar 20 µ l de Buffer de ensaio para as colunas 1 e 2 da linha H, ver tabela 1. Carrega 30 µ l de cada amostra, em duplicado, a linha H da placa de ensaio. Por exemplo, dispense 30 µ l de amostra 1 em poços 3 H e 4 H e dispense 30 µ l de amostra 2 em poços 5 H e 6 H, etc. Execute 3 vezes diluições em série de amostras de teste, usando uma pipeta multicanal. Remover 10 µ da amostra de poços 3H – 12H e transferência para poços correspondentes na linha G e misturar a amostra bem pipetando para cima e para baixo 8 – 10 vezes. Em seguida remover 10 µ de poços 3G – 12g e transferência para poços correspondentes na linha F e misture bem. Continuar estas diluições em série através da linha A. Após a mistura dos poços na linha A, remova e descarte a 10 µ l de poços 3A-12A para que todos os poços contenham 20 µ l.Nota: Porque 20 µ l de soro é usado em um volume total de ensaio de 80 µ l, há uma 4-fold diluição adicional no ensaio. Esta diluição deve ter em conta durante o cálculo de um título de SBA multiplicando a diluição do soro por 4. Por exemplo, se uma diluição inicial de 1:2 é usada, a diluição real sendo testada é 1:8. Remova um frasco de estoque de bactérias alvo congelado e descongelar à temperatura ambiente. Dilua as bactérias em 20 mL de tampão de ensaio de acordo com o fator de diluição ideal pré-determinado (esse fator de diluição foi determinado na seção 2.3). Adicione 10 µ l de bactérias diluídas a cada poço da placa de ensaio, utilizando uma pipeta multicanal. Retire um frasco de BRC congelado e um frasco de congelados-inactivados por calor, BRC, descongelar à temperatura ambiente com água corrente fria ou coloque na grelha de uma câmara de segurança biológica do armário com sopro de ar para descongelar rapidamente. Prepare uma solução de 20% da BRC inactivadas pelo calor. Mix 100 µ l de BRC inactivadas pelo calor com 400 µ l de Buffer de ensaio. Adicione 50 µ l desta solução de BRC 20% inactivadas pelo calor a todos os poços na coluna 1 (controle A poços).Nota: BRC inactivados por calor, é usado como um controle para monitorar a matança não-específica (NSK) no ensaio. Prepare uma solução de 20% da BRC nativo. Misture 1 mL de BRC nativo com 4 mL de tampão de ensaio. Adicione 50 µ l de mistura para todos os poços nas colunas 2 a 12 (poços de amostra B de controle e teste).Nota: A concentração final de BRC na mistura de reação é de 12,5%. Brevemente misture placa de ensaio agitando suavemente para 10-15 s num agitador de placa ou misturar pipetando e descer 8 vezes usando uma pipeta multicanal. Colocar a placa de ensaio na incubadora microbiológica de 37 ° C por 2 h (sem agitação). Seca 2 placas LBA, removendo as tampas e colocando placas enfrentam segurança microbiológica para 40-60 min. Quando a incubação de 2 h for concluída, mova a placa de ensaio molhado gelo e incubar por 10-20 min parar a reação. Utilizando uma pipeta de 12 canais, misture os poços na linha H e a placa local 10 µ l da mistura de reação para o fundo de uma placa LBA. Imediatamente incline a placa e permitem que as manchas correr para ~1.5-2 cm. Repita este procedimento para linha G, F e E detectá-las acima da linha anterior na placa LBA. Linha E, F, G e H são manchadas em uma placa LBA e linha A, B, C e D são manchadas em uma segunda placa LBA da mesma forma, veja a Figura 1. Incube as placas LBA em temperatura ambiente até que a solução é adsorvida nas placas LBA (10-15 min). Colocar as tampas nas placas LBA e colocar as placas LBA na incubadora microbiológica de ponta-cabeça para incubar durante uma noite (~ 16-18 h). Incubar a S. flexneri 2a e 3a a 29 ° C e incubar S. sonnei é a 26 ° C.Nota: Estas temperaturas rendem “microcolônias menores” com tamanhos apropriados para contagem exata por um contador de colônia9. Após a incubação durante a noite, adicione 25 mL de ágar Overlay (a ~ 55 ° C) contendo 100 µ g/mL TTC e 0,1% NaN3 para cada placa LBA. Incube as placas LBA a 37 ° C por 2 h permitir que as bactérias sobreviventes para desenvolver a cor vermelha, veja a Figura 1 abaixo. Fotografar as placas usando uma câmera digital e transferir imagens para um computador onde foi instalado colônia enumerando Software integrado do NIST (NICE), ver Figura 2.Nota: BOA contagem de colônia software está disponível sem nenhum custo. Consulte a Lista de materiais para detalhes e instruções de instalação. 4. contagem de colônias de bactérias Open Software legal e entrada Nome de operador, informações do experimento e qualquer ensaio notas para os campos vazios. Uma vez que este dados são inseridos, clique no botão feito . Importe placas fotografadas clicando no botão abrir e selecionar os arquivos corretos do computador. Ajuste os parâmetros de ensaio, definindo o número de linhas para 4 e o número de colunas para 12. Ajuste a configuração de plano de fundo ao sigma-3 e a resolução para baixo. Consulte a Figura 2. Mova a regiões de interesse (ROIs), clicando e arrastando para que cada ROI está diretamente sobre o ponto de uma amostra. Certifique-se de que todas as colônias bacterianas estão dentro o ROI com nenhuma sobreposição entre as amostras. Concluído um prato, dê um duplo clique a seguinte placa na lista de imagens de dados armazenados e ajustar o ROIs. Consulte a Figura 2. Quando todas as placas foram ajustadas, clique no botão verde de contagem , veja a Figura 2 e Figura 3. Quando a contagem terminar clique no botão Exportar para exportar os dados no formato.xls/.xlsx. Nomeie e salve o arquivo.xls/.xlsx para análise de dados. Organizar exportados dados em um formato de tabela, para que acusações são organizadas em uma tabela que representa a placa de 96 poços de ensaio, ver tabela 2. 5. calcular o Titer SBA (KI) e matar não-específica (NSK) Nota: Título de SBA, ou índice de mortes (KI) é definida como a recíproca da diluição do soro que mata 50% da bactéria alvo. Calcule a 50%, matando o valor limite de índice (KI) em média a CFU de poços de controle do complemento ativo (Control B) e dividindo por 2. Calcular a média CFU por cada diluição de cada amostra que foi executada em duplicado, consulte a tabela 3. Porque uma diluição do soro raramente produzirá exatamente esse valor KI de 50%, que podem ser interpolados de duas diluições do soro sequencial, que mata a menos de 50% e que mata mais de 50%, veja a Figura 4. A fórmula para calcular o KI SBA interpolados é mostrada abaixo:Nota: A concentração bactericida, ou KI, também pode ser calculado automaticamente usando o software de Opsotiter desenvolvido pela UAB. Para solicitar Opsotiter, entrar em contato com o Dr. Moon Nahm ou Sr. Rob Burton. Consulte https://www.vaccine.uab.edu para informações de contato. Calcular o valor NSK tomando 1 menos a média de controle B dividido pela média de controle A.