一种高通量志贺氏菌特异性杀菌试验

该协议遵循 wrair 人类主体保护委员会的准则。本研究中使用的样本是作为 wrair 议定书第1328号的一部分收集的人类血清样本, 符合所有关于保护人体的机构和联邦条例。对样本进行了注销鉴定, uab irb 将这些匿名样本的使用归类为非人类主题研究 (协议号 n150115001)。 1. 制备检测试剂 在100毫升的水中加入1克明胶, 制备1% 的明胶。高压灭菌器, 并在室温下存放。 在40毫升水中加入5克 ttc, 制备 100 mg/ttl (2, 3, 5-三苯基四唑氯化) 库存溶液 (1, 000 x)。当 ttc 完全溶解时, 使用水和无菌过滤器将体积调整到50毫升, 使用0.2μm 过滤器。将溶液存放在 4°c, 并防止光线照射。请注意:ttc 使细菌菌落着色, 使其更容易计数。ttc 溶液有轻微的黄色。如果 ttc 溶液发展出红色, 丢弃并准备新鲜。 加入5克 nn3l 至 40毫升的水, 制备10% 的氮化钠 (nn3) 库存溶液 (100x) 。完全溶解后, 将水添加到50毫升。在室温下存放。注意事项:氮化钠是一种毒药, 如果通过皮肤或眼睛摄入或吸收, 可能会有毒。它可能与铅和铜管道发生反应, 形成高度爆炸性的金属氮化物。在处置含有氮化钠的试剂时, 用大量的水冲洗, 以防止氮化物积聚或丢弃在生物危害袋中。 在1升的水和高压灭菌器中加入35克的 lb 琼脂, 制备 lba 板 (lb 琼脂板)。在每个方形培养皿中加入25毫升 (120 x 120 毫米2)。在 rt 中加层 10-20, 使琼脂凝固。将盘子放回塑料袋中, 并在4°c 下存放长达1个月。 在 1, 000 毫升的水和高压灭菌器中加入7.5 克琼脂, 准备覆盖琼脂。在56°c 的水浴中孵化, 直到需要。使用前, 加入1毫升 100 mgml ttc 和 10% nan3的10毫升, 搅拌均匀。请注意:每个 lba 板需要25毫升的覆盖琼脂。覆盖琼脂可以提前一个月准备, 并根据检测需要在微波炉或热板上融化。在应用 lba 板之前, 请确保琼脂温度约为55°c。 加入5ml 的 10倍 hanks 平衡盐溶液 (hbss), 加上ca 2 +/mL2 +和 5 ml 的1% 明胶至40毫升的水, 制备检测缓冲液。在室温下存放。 2. 准备补体和靶向细菌 准备小兔补体 (brc)请注意:补充手选的详细标准可以在这里找到: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf 获得冷冻 brc, 用自来水解冻。每隔10-20 将 brc 物理混合, 直到完全解冻。不要让 brc 反复进行冷冻解冻循环。 当 brc 解冻时, 标签 1.5 ml、5ml 或 15 ml 离心管。将贴有标签的管子放在冰上预冷却。倾斜适当体积的 brc 到预冷离心管 (灌装后, 立即将每个管返回冰面)。将等价物存放在≤-70°c 的冰柜中。请注意:每个检测板大约需要1米的补体。补充等价物是一次性使用的, 应以适合于分析布局的卷的数量进行。 为了准备热灭活的 brc, 解冻一个活跃的 brc。准备56°c 的水浴。brc 完全解冻后, 将其转移到水浴中, 孵育 3 0分钟。 孵育后, 从水浴中取出热灭活 brc, 并允许在 rt 冷却 10-15, 用力混合, 并使用约150μl 至 1.5 ml 微离心管。在≤-10°c 下储存等价物。 准备目标细菌库请注意:下面的程序用于制备48个目标细菌储备的等价物;如果需要更多的等价物, 协议可以扩大规模。 从冰柜中取出细菌主储存的小瓶, 刮掉冷冻的细菌表面, 将少量的冰从小瓶中取出到血琼脂板上。立即将主库存小瓶返回到冰柜。 将这种小的细菌库存撒在血琼脂板上, 盖上锅盖。在 37°c% co-2 孵化器中倒置板. 将 ~ 10个孤立的光滑菌落转移到含有30毫升 lb 肉汤的50毫升管中。在37°c 孵育 3-5小时, 轻轻摇晃, 直到培养液的 od 600 ~ 0.6-0.7。 收获最上面的12.5 毫升的培养, 并转移到一个新鲜的50毫升管。使用桌面微型离心机以 15, 000 x 克离心培养物2分钟。丢弃上清液, 在25% 无菌甘油 lb 的25毫升中重新悬浮颗粒。 将0.5 毫升的 aliquots 混合均匀, 放入无菌 1.5 ml 微型离心管 (~ 48 管) 中。将等价物存放在≤-70°c 的冰柜中。 使用前使用凝集试验确认细菌身份。 目标菌群最佳稀释因子的测定请注意:每批靶向细菌库存必须在检测条件下滴定, 以确定在 lb 板上产生 ~ 120 cfu/点所需的稀释。 得到一个微滴板 (稀释板), 并加入135μl 的检测缓冲液, 以良好的1a。在1b-1h 井中加入120μl 的检测黄油。 从冰柜中取出一小瓶冷冻靶部细菌, 并在室温下解冻。将 15 ul 解冻的细菌库存添加到 1 a, 使细菌库存稀释10倍。 将30μl 的细菌溶液从 1 a 井转移到1b 井进行5倍的连续稀释。继续进行5倍的串行稀释, 使1h 井, 共8次稀释 (1:10; 1:50; 1: 250; 1: 1 250; 1: 6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250)。 获取另一个微滴板 (检测板), 并在检测板第1列和第2列中的所有井中添加20μl 的检测缓冲器。 将稀释板第1栏中每口井中的10μl 稀释细菌转移到测定板第1栏和第2栏的相应井中。10μl 细菌从稀释板的1a 井转移到检测板中的1a 井和2a 井等。 继续进行下面控制 a 和控制 b 的血清杀菌鉴定 (sba) 中所述的检测, 步骤 3.6-3.12。 在冰上孵育板后, 使用带有8个移液器吸头的多通道移液器将第1列中的井中的10μl 点到 lba 板上。此外, 将从第2列到 lba 板上的井点。 继续进行步骤3.14-4.6 中所述的检测。 测定在控制 b 中产生 ~ 120个 cfu®的细菌稀释, 该稀释将用于检测。 3. 血清杀菌试验 (sba) 请注意:下面描述的过程是一个检测板, 但可以增加检测板的数量。 在56°c 的水浴中孵育样品 30分钟, 使热失活测试样品。请注意:测试样品必须在测试前被热失活, 以废除任何内源补活活性。这可以在检测前完成, 在测试之前, 可以在4°c 下重新冷冻或储存灭活样品。 获取检测板, 并将20μl 的检测缓冲区添加到第1行到第12列 a 到 g. 在 h 行的第1列和第2列添加20μl 的检测缓冲区, 请参见表 1。 加载每个测试样品的 30μl, 一式两份, 到检测板的 h 行。例如, 将样品1的30μl 分配到井3h 和4h 中, 并将样品2的30μl 分配到5h 井和6h 井等中。 使用多通道移液器对测试样品进行3次串行稀释。 将样品从3h-12h 井中取出 10μ, 转移到 g 排的相应井中, 通过向上和向下移液混合样品8-10 次。 然后从3g-12g 井中去除 10μ, 转移到 f 排相应的井中, 搅拌良好。 继续这些连续稀释通过行 a。在 a 排混合井后, 从3a-12a 井中取出并丢弃 10μl, 使所有井都含有20μl。请注意:由于血清20μl 用于80μl 的总测定体积, 因此在测定中有4倍的额外稀释。在计算 sba 滴度时, 必须将血清稀释量乘以 4, 从而考虑到这种稀释。例如, 如果使用 1: 2 的开始稀释, 则实际进行稀释的时间为1:8。 取出一小瓶冷冻目标细菌库存, 在室温下解冻。根据预先确定的最佳稀释系数 (第2.3节确定了该稀释系数), 稀释检测缓冲液20毫升中的细菌。使用多通道移液器将10μl 稀释后的细菌添加到检测板的每口井中。 取出一小瓶冷冻 brc 和一小瓶冷冻热灭活 brc, 在室温下用自来水解冻, 或放置在生物安全柜的格栅上, 吹气迅速解冻。 准备20% 的热灭活 brc 溶液。将100μl 的热灭活 brc 与400μl 的检测缓冲器混合。在第1栏 (控制 a 井) 的所有井加入50μl 的这种20% 的热灭活 brc 溶液。请注意:热灭活 brc 被用作监测检测中非特异性杀伤 (nsk) 的对照。 准备20% 的本地 brc 解决方案。将原生 brc 的1毫升与4毫升的检测缓冲区混合。将这种混合物的50μl 添加到第2至第12栏的所有井 (控制 b 和测试样品井) 中。请注意:反应混合物中 brc 的最终浓度为12.5%。 在板振动台上轻轻晃动 10-15, 或使用多通道移液器上下移液 8次, 将检测板快速混合。 将检测板放入37°c 微生物孵化器中 2小时 (不晃动)。 通过取下盖子和放置板面朝上干燥 2 lba 板, 在生物安全柜中擦干40-60分钟。 2小时孵育完成后, 将检测板移动到湿冰上, 孵育10-20 以停止反应。 使用12通道移液器, 将井在 h 排中混合, 并将反应混合物的点板10μl 固定在 lba 板的底部。立即倾斜板, 让斑点运行 ~ 1.5-2 厘米. 对 g、f 和 e 行重复此过程, 在 lba 板上的前一行上方发现它们。e、f、g 和 h 行被发现在一个 lba 板上, a、b、c 和 d 行以同样的方式被发现在第二个 lba 板上, 见图 1。 在室温下培育 lba 板, 直到溶液吸附到 lba 板中 (10-15)。将盖子放在 lba 板上, 并将 lba 板倒置在微生物孵化器中, 隔夜孵育 (约 16-18小时)。在29°c 孵育 s. flexneri 2a 和 3a, 在26°c 孵育 s. sonnei 。请注意:这些温度产生较小的 “微菌落”, 其大小适合由菌落计数器9 精确计数. 隔夜孵育后, 在每个 lba 板上加入25毫升的覆盖琼脂 (~ 55°c), 其中含有 100μgml ttc 和0.1% 的 nan3 。 在37°c 下将 lba 板培养 2小时, 以使幸存的细菌产生红色, 见下文图 1 。 使用数码相机拍摄的照片板, 并将图像传输到安装了 nist 集成群枚举软件 (nice) 的计算机, 请参见图 2。请注意:尼斯殖民计数软件是免费提供的。有关详细信息和安装说明, 请参阅材料列表。 4. 细菌性菌落计数 打开 nice 软件, 并将操作员姓名、实验信息和任何检测说明输入空字段。输入此数据后, 单击”完成”按钮。 通过单击 “打开”按钮并从计算机中选择正确的文件来导入拍摄的印版。 通过将行数设置为4和将列数设置为12来调整分析参数。将 “背景” 设置调整为-3 西格玛, 将”分辨率” 调整为 “低”。请参见图 2。 通过单击和拖动移动感兴趣的区域 (roi), 以便每个 roi 直接位于一个示例点上。确保所有细菌菌落都在投资回报率内, 样品之间没有重叠。完成一个板后, 双击 “存储数据图像” 列表中的下一个板, 然后调整 roi。请参见图 2。 调整完所有板后, 单击绿色计数按钮, 请参见图2和图 3。计数完成后, 单击”导出” 按钮以. xls1. xlsx 格式导出数据。命名并保存. xls1. xlsx 文件以进行数据分析。 将导出的数据排列为表格格式, 以便在表示96孔检测板的表中组织计数, 请参见表 2. 5. 计算 sba 标题 (ki) 和非特异性杀戮 (nsk) 请注意:sba 滴度, 或杀死指数 (ki) 被定义为血清稀释的倒数, 杀死50% 的目标细菌。 通过对活性补体控制井 (控制 b) 的 cfu 进行平均和除以 2, 计算50% 的杀灭指数 (ki) 截止值。计算每一个重复运行的样本的平均 cfu, 见表 3。 由于血清稀释很少能准确地产生这个50% 的 ki 值, 所以它可以通过两种连续的血清稀释中插值, 一种是杀死不到50% 的, 另一种是杀死50% 以上的, 请参见图 4。计算插值 sba ki 的公式如下所示:请注意:细菌滴度, 或 ki, 也可以使用 uab 开发的 opsotiter 软件自动计算。如需使用 opsotiter, 请与 moon nahm 博士或 rob burton 先生联系。有关联系信息, 请参阅 https://www.vaccine.uab.edu。 通过取1减去控制 b 的平均值除以控制 a 的平均值来计算 nsk 值。