평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

모든 환자와 건강 한 컨트롤 LUMC biobank에 참여 동의. 두 biobanking 연구 LUMC 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 1입니다. 건강 한 호 중구의 격리 2 개의 10 mL EDTA 코팅 관에 건강 한 기증자 로부터 말 초 혈액의 20 mL를 얻을. 살 균 50 mL 튜브에 혈액 10 mL를 넣어 고 추가 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 최대 32.5 mL. 추가 셀 아래 밀도 그라데이션 (예:., Ficoll-amidotrizoaat). 받아 밀도의 14 mL를 피펫으로 컨트롤러와 10ml 피펫으로 그라데이션 50 mL 튜브의 하단에 피펫으로 장소. 모 세관 효과 의해 최대에 도달할 때까지 중력 있는 피펫으로에서 흐름 밀도 그라데이션 수를 피펫으로 오프 피펫으로 컨트롤러를가지고 (1-2 mL 남아 있을 것입니다), 모터를 사용 하지 않고. 피펫으로 피펫으로의 제거 하는 동안 밖으로 누출에서 밀도 그라데이션 방지 피펫으로 위에 엄지를 삽입 하 여 제거 합니다. 912 x g 및 가속 또는 브레이크 없이 실 온 (RT)에서 20 분 동안 튜브를 회전 합니다.참고: 적혈구 (RBC)와 호 중구 높은 밀도 있고 50 mL 튜브의 하단에 있습니다. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) 있으며 분리 밀도 그라데이션 위에 흰색 링으로. PBS 희석 플라즈마는 PBMCs에 위에 있을 것입니다. 필요한 경우 PBMCs 추가 세척 단계 PBS 가진 새로운 50 mL 튜브에 백색 반지를 전송 하 여 고립 될 수 있다. 조심 스럽게 PBS 희석 플라즈마 및 마지막으로 가능한 만큼 밀도 그라디언트 레이어 제거 다음 PBMCs를 포함 하는 것은 첫째, 백색 반지 제거. Neutrophil/적혈구 믹스에서 호 중구 분리, 차가운 멸 균 증류수로 적혈구를 lyse. 차가운 멸 균 증류수 물 병을 10 배 집중 냉장고에서 PBS 플라스 크. 이 단계에 대 한 신속 하 게 작동 합니다. 펠 릿 위에 직접 냉 멸 균 증류수의 36 개 mL를 추가 하 고 한 번 신중 하 게 섞으십시오. 20 후 10 x PBS의 4 개 mL를 추가 isotonic 솔루션 s. 한 번 신중 하 게 믹스. 5 분 739 x g 와 4 ° C (Rbc의 제거)에 대 한 튜브를 회전 합니다. 호 중구는 흰색 펠 릿에 있을 것입니다. 신중 하 게는 상쾌한을 삭제 합니다. 1.6.2 단계를 다시 수행 하 고 펠 릿 제대로 중단 된 ㄴ 다는 것을 확인. 328 x g 5 분 및 4 ° c.에 대 한 튜브를 회전 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 PBS의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend. 호 중구 계산 하 고 얼음에 그들을 유지.참고: 혈액 (10 mL)의 1 튜브에서 예상된 수확량은 약 백만 15-75 호 중구. 2. 빨간 형광 세포 호 중구의 라벨 2 mL PBS의 15 mL 튜브에서에 10-20 백만 호 중구의 호 중구 정지를 확인 합니다. 2 µ M 빨간색 형광 셀 링커의 4 µ L 2 mL PBS의 솔루션 ( 재료의 표참조) 다른 15 mL 튜브에. 부드럽게 호 중구 정지에 이것을 추가 하 고 신중 하 게 혼합. 빨간 형광 셀 링커는 중 성구를 37 ° C에서 정확히 25 분 동안 어둠 속에서 품 어. 비활성화 라벨 10% 열 포함 된 RPMI 1640 매체 비활성화 소 태아 혈 청 (FCS)을 추가 하 여 실시간에 최대 15 mL와 혼합 한 번 신중 하 게. 펠 릿을 형성 하는 경우 펠 릿 신중 하 게 resuspended 다는 것을 확인 하십시오. 328 x g 및 실시간 5 분에 대 한 튜브를 회전 제거는 상쾌한 고 페 놀 레드 무료 RPMI 1640의 5 mL에 펠 릿을 resuspend 2 S 및 10% 포함 된 중간 P/S 실시간에는 호 중구 계산.참고: 50%의 셀 손실 빨간 형광 셀 라벨 후 발생할 수 있습니다. 3입니다. 호 중구 Extracellular 함정 형성의 유도 셀 정지 0.42 x 106 셀/mL에 페 놀 레드 RPMI 1640 중간 포함 2 S 10%를 무료 하 게 P/s. 검은 96-글쎄, 플랫 바닥 접시에 잘 당 90 µ L에서 37,500 neutrophils를 추가 합니다. 우물에서 10%의 농도 도달 하는 3 중에서 선택한 자극 (예를 들어, 환자의 세라)의 10 µ L를 추가 합니다. 항상 3 중에 부정적인 제어 (중간)를 포함 합니다. H. 잠복기 4 h 제안에 대 한 2, 4 또는 6에서 30 분까지 원하는 시간에 대 한 37 ° C에서 어둠 속에서 품 어. 필요한 추가 25 µ L 5 µ M 스며들 지 않는 DNA의 염색 ( 재료의 표참조), 우물에 1 µ M의 최종 농도 도달 하는 볼륨을 계산 합니다. 만들기는 predilution 필요한 경우 RPMI 1640 중간 포함 2 S 10 %P / S 5 µ M 농도를. 보육 시간의 끝 전에 5 µ M 스며들 지 않는 DNA 염색 15 분의 25 µ L를 추가 합니다. 어둠 속에서 37 ° C에서 또 다른 15 분 동안 부 화를 계속 합니다. 매우 신중 하 게 상쾌한 (~ 125 µ L)를 제거 하 고 필요한 경우 저장. 4 %paraformaldehyde (PFA)의 100 µ L를 추가 합니다. 어둠 속에서 유지 하 고 즉시 4 단계를 계속. 4. NET 시각화 3D이 콘텐츠, 고해상도 면역 형광 검사 Confocal 현미경 검사 법으로 인수 설정을 클릭 하 여 면역 형광 검사 confocal 현미경에 설정을 구성 합니다. 구성 탭에서 클릭 합니다. 목표와 카메라를 선택 합니다. Confocal 60 µ m의 작은 구멍의 수집 모드와 10 X Apo 람다 목표를 선택 합니다. 접시 에 클릭을 선택 플라스틱 96 잘 접시. 방문 하 여 고정 된 수의 사이트를 선택 사이트를 선택 합니다. 커버는 잘의 45%의 총 오버랩 (0 µ m), 없이 3 행과 3 열을 입력 합니다. 수집을 클릭 합니다. 초점 레이저 기반 활성화선택 하십시오. 필요한 경우 인수 Z 시리즈/시계열 을 선택 합니다. 사이트 자동 초점을 클릭 하십시오. 접시 바닥에 초점 을 클릭 | 바닥 두께 의해 떨어져 설정합니다. 첫 번째 잘 선택, 샘플을 찾을 수 초기 잘 인수. 사이트 자동 초점에 대 한 모든 사이트를 선택 합니다. 파장을 클릭 하십시오. 파장의 수 2를 선택 하십시오. TL 음영 보정 상세 레벨에 대 한 2를 선택 합니다. 파장 1, 텍사스 레드를 선택 합니다. 자동 옵션을 선택 레이저 Z 오프셋에 대 한 게시 레이저 오프셋 1.1 µ m. 사용 Z-스택 사용자 지정 범위 200-10의. 파장 2 FITC를 선택 합니다. 자동 옵션에 대 한 선택 레이저 w1에서 Z 오프셋 0 µ m.를 사용 하 여 Z-스택 200-10의 사용자 지정 범위. 인수 옵션에 대 한 Z 시리즈 및 최대 2D 프로젝션 이미지를 선택 합니다. 인수 옵션 선택 음영 보정 | . Z 시리즈를 선택 합니다. 단계 수를 선택: 10. 단계 크기 선택: 3 m m (전체 범위는 27 µ m를 될 것입니다). 면역 형광 검사 confocal 현미경 검사 법에는 접시를 넣어. 실행 탭을 클릭 하십시오. 플레이트 이름 및 설명을 입력 하 고 저장 위치를 선택 합니다. 취득 하는 우물을 선택 합니다. 텍사스 레드와 FITC에 대 한 노출 시간을 선택 합니다. 취득 접시 접시 당 약 1 시간을 걸릴 것입니다 인수, 시작을 클릭 하십시오. 5입니다. 그물 형성 분석 그물 형성 분석을 과학적인 다차원 이미지 ( 재료의 표참조)의 분석에 대 한 설계 된 프로그램을 처리 하는 이미지를 사용 합니다. 획득된 한 이미지 데이터를 별도 하드 드라이브를 전송. 도구를 추가 하는 색상을 선택 합니다. W1 선택한 데이터가 저장 된 하드 드라이브에서 폴더를 선택 합니다. W2 선택한 데이터가 저장 된 하드 드라이브에서 폴더를 선택 합니다.참고: 텍사스 레드 이미지에 붉은 색을 추가 하려면 파일 이름에 w 1를 사용 하 여 녹색 색상 이미지를 추가 FITC w2 사용 하는 표준 매크로 사용 합니다. 분석 매크로 선택 합니다. W1선택, 임계값 값 (강도 임계값)는 일반적으로 10을 선택 합니다. 원하는 픽셀 값 (크기 임계값, 예를 들어, 100)을 선택 합니다. W2선택, 임계값 값 (강도 임계값)는 일반적으로 10을 선택 합니다. 원하는 픽셀 값 (크기 임계값, 예를 들어, 500)를 선택 합니다. 분석, 실행 스프레드시트 파일의 대상을 선택 하 고 나중에 로그 파일을 저장. 스프레드시트에서 데이터를 분석 합니다.