Probiotische Studies in neonatale muizen met behulp van de maagsonde

Alle procedures werden uitgevoerd met betrekking tot de richtsnoeren die zijn vastgelegd door het ondersteunend personeel bij het dier zorg faciliteit aan de University of British Columbia en alle procedures door het UBC Animal Care Comité zijn goedgekeurd. 1. kwantificering van probiotica beheerd Opmerking: Deze stap wordt aanbevolen om te bepalen van het exacte bedrag van probiotische CFU die in een enkele dosis kan worden beheerd. De hoeveelheid probiotica en voertuig (FOS en maltodextrine) bepaalt de voorwaarden van de verzadiging van de oplossing. Uit ervaring, kan niet meer dan 30 µL (~ 20 mL per kg) van de vloeistof worden toegediend aan muizen op DOL 2, zoals een groter volume risico op aspiratie verhoogt. Zes 1,5 mL microcentrifuge buizen voorbereiden met seriële verdunningen met elke buis met 180 µL steriele 5% dextrose zoutoplossing. Weeg een 0.2 g aliquoot deel van een probiotische-prebiotisch mengsel en los het op in 1 mL dextrose 5% zoutoplossing in een steriele wijze. Vortex voor 30 seconden en Pipetteer te breken van de bosjes. Herhaal totdat er geen zichtbare klontjes in acht worden genomen.Opmerking: Maltodextrine maakt de oplossing viskeuze en bijdragen tot de oplossing verzadiging. Het uitvoeren van een seriële verdunning met behulp van buizen in stap 1.1 voorbereid. Vortex te mengen. Plaat 40 µL van elke verdunning op een gelabelde kwadrant van de MRS agarplaat. Plaat van elke verdunning in tweevoud. Incubeer onder anaërobe (of microaerophilic) omstandigheden bij 37 ° C gedurende 48 uur in een vacuüm jar gebruik van een gas-pack. Elke plaat binnen een bereik van 20-70 per Kwadrant kolonies te tellen. Gemiddelde plaat geteld met de dezelfde verdunning en terug naar de gewenste eenheden te berekenen. 2. voorbereiding van probiotica en prebiotica maagsonde Opmerking: De juiste ontbinding van probiotische en prebiotisch is nodig om ervoor te zorgen de soepele injectie vloeistof via de voeding naald tijdens maagsonde. Combineer het normbedrag van gelyofiliseerd probiotische organisme met de gewenste hoeveelheid prebiotica en voertuig in een steriele microcentrifuge buis. Voeg toe de passende hoeveelheid oplosmiddel (5% dextrose saline) te ontbinden de probiotische-prebiotisch mengsel.Opmerking: De capaciteit van ontbinding is beperkt door de prebiotische en voertuig gebruikt. Vanuit ervaring bereikt de synbiotic combinatie (met FOS en maltodextrine) verzadiging bij ongeveer 0,3 g/mL terwijl ontbinding in een tube van 2 mL microcentrifuge met behulp van 1 mL oplosmiddel. Vortex te mengen totdat alle vaste stoffen zijn opgelost. Gebruik een pipet te breken bolletjes van vaste deeltjes in het oplosmiddel op en neer waarbij eveneens. Incubeer de oplossing in een waterbad 37 ° C gedurende 20 minuten.Opmerking: Deze stap kan worden overgeslagen als de probiotische-prebiotisch oplossing wordt gemaakt uit een levende cultuur. Plaat met een vijf series 10-fold verdunning op MRS agar platen voor maagsonde te kwantificeren nauwkeurig de probiotische toegediend aan de pup. Deze stap kan worden overgeslagen als de nauwkeurige CFU tellen is niet nodig. 3. bereiding van het biosafety kabinet Gebruik een kabinet bioveiligheid bij het werken met probiotica te handhaven aseptische techniek. De kooi met de dammen en pups op een Verwarming Deken (ingesteld op ongeveer 38 ° C) instellen op een helft van de deken. Plaats een schoon, lege dierlijke kooi op de andere helft van de verwarming deken. Plaats een ontsmet of gesteriliseerd, absorberend pad op de verwarming deken om de neiging om de muis tijdens maagsonde. Verzamelen van nesten materiaal voor de pups vanaf de bovenkant van de bestaande, dam-gemaakt nest en maak een nieuwe conische nesten beker met behulp van gehandschoende handen, ontsmet is met 70% ethanol en gedroogd. Plaats deze nieuwe nest in de kooi schoon, lege bedrijf. Dit vergemakkelijkt de overdracht van de geur van het nest naar de gehandschoende handen en dus minimaliseert de invoering van andere geuren op de pup tijdens het verwerken van hen voor de procedure, waardoor het risico van kannibalisatie. Verhuizen de pups naar de conische nest houden kooi en verwijder de kooi met de dam van het kabinet. Dit vermindert de stress op de dam door te voorkomen dat het horen van de pups tijdens de procedure.Opmerking: Als de probiotische een bekende kolonisator van de lymfkliertest darmen is, de voorwaarden van de behandeling moeten worden gescheiden door kooien of zelfs verschillende bioveiligheid kasten om te voorkomen dat de mogelijkheid van grensoverschrijdende kolonisatie. 4. Intra-oesofageale maagsonde van neonatale muis Open de verpakking van de spuit voor gemakkelijke toegang. De verpakking van de naald op een steriele wijze geopend en deze koppelen aan het hoofd van de spuit. Wassen van de naald met 70% ethanol en autoclaaf vóór de ingreep. Gebruik verschillende sets van naalden voor de behandeling en de controlegroep om verontreiniging te voorkomen. Trekken een beetje meer dan de gewenste hoeveelheid probiotic-kleurstof oplossing in de spuit. Houdt de spuit naar boven. Vervolgens pull-down verdere en flick met vinger te verjagen bubbels en druk op de plunjer tot uitzetting van de belletjes en het extra vloeibare volume totdat het gewenste volume is bereikt. Dit zorgt ervoor dat er geen ruimte van de lucht in de naald is. Voor DOL-2-muis, de omvang van de maagsonde mag niet meer dan 30 µL. Plaats de pup op het steriel absorberend stootkussen op de top van de verwarming pad. De voeding naald (24 Gauge, 1″ lengte van de naald, 1.25 mm bal diameter) extern gebruiken voor het meten van de lengte van de slokdarm door het plaatsen van de bal van de naald net onder de xiphoid process (onderste eind van het borstbeen). Mark de naald op het niveau van de snuit te merken van de limiet van het inbrengen van de naald (Figuur 1). Observeer de pup voor gezondheidssignalering, waaronder regelmatige ademhaling en roze verkleuring van de huid. Dompel het puntje van de naald in het onderdompelende oplosmiddel (5% dextrose zoutoplossing of het medium gebruikt voor het ontbinden van de probiotische en prebiotische) te smeren de externe oppervlakken van de voeding naald. Dit vergemakkelijkt de soepele binnenkomst van de naald in de slokdarm van de muis. Til de pup door de scruff of door het hoofd en het lichaam tussen de duim en de wijsvinger zachtjes te houden. Zorgen voor het hoofd, hals en lichaam in een rechte positie worden gehouden. Houd niet de pup door de scruff voor langer dan 60 s als er is een risico van obstructie van de trachea leiden tot verstikking. Zorg ervoor dat de pup kan ademen. Tekenen van scruffing te hard kunnen zijn onvermogen om te ademen, aanzienlijke hijgend en de tong uit de mond uitgebreid. Monitor de kleur en de ademhaling tijdens de gehele procedure van de pup. Plaats de lamp van de naald in het midden van de mond van de pup in een hoek van 45° op het vlak van de romp totdat zij de achterkant van de keel tot. Zachtjes het wijzigen van de hoek van de naald door het draaien op de bol van de naald en verplaatsen van de injectiespuit weg van de persoon van de gavaging (naar de dorsale zijde van de pup) totdat het is evenwijdig zijn aan het vlak van de wervelkolom van de pup. Scruffing de pup zorgt u ervoor dat de naald op zijn plaats in de achterkant van de keel, en voorkomt bovendien dat de muis tollen. Zorg ervoor dat de bal van de naald niet verder of het uitoefenen van druk tegen de achterkant van de keel tijdens de verandering van de hoek. Als de muis probeert te slikken van de naald, laat het natuurlijk Schuif naar beneden en arresteren van de beweging wanneer de markering op de naald wordt uitgelijnd met de snuit. De spuit en de naald zijn meestal zwaar genoeg om dia beneden de vervaldatum aan de zwaartekracht. Steun het gewicht van de naald te allen tijde zodat de naald dia’s gemakkelijk onderaan de slokdarm met geen neerwaartse druk van de persoon die uitvoering van de maagsonde. Als de naald voldoet aan weerstand in de achterkant van de keel, trekken de naald van de maagsonde iets te verjagen van de bal van de naald en opnieuw hoek de naald binnenkant van de mond naar links van de muis (handler van rechts) langzaam in kleine, 1 mm stappen. De naald moet gaan gemakkelijk schuif naar beneden van de slokdarm. Als de naald stopt voordat de markering op de nld de mond tot, niet de oplossing injecteren. Houd niet de naald ingevoegd voor meer dan 20 s. Als dit gebeurt, intrekken van de naald langzaam terwijl de spuit parallel aan de romp, en laat de pup die rusten op de papieren handdoek voor 30 s tot 1 min. proberen gavaging weer na het smeren van het buitenoppervlak van de naald met het oplosmiddel.Opmerking: Anesthesie wordt niet gebruikt voor de procedure van de muis respons is noodzakelijk om te meten van het succes van de maagsonde. Wanneer de markering op de voeding naald is boven de snuit en uitgelijnd met de punt van de snuit, laat niet de naald verplaatsen of om het even welk verder verder. Langzaam injecteren de gewenste hoeveelheid vloeistof. Als de vloeistof is aanzuiging of aan bubble via de neus waargenomen, de injectie onmiddellijk stoppen en langzaam het intrekken van de naald. Plaats de pup rechtop op de papieren handdoek op de verwarming pad om te helpen bij haar herstel. In de gaten voor verdere ademhalingsproblemen of wijzigen in de kleur van de pup die streven aangeeft. Pups die onmiddellijk hebben aanzuiging euthanaseren. Zodra de maagsonde voltooid is, zachtjes trekken de voeding naald onder dezelfde hoek die het is ingevoegd. Plaats de pup op de papieren handdoek op de verwarmde verwarming pad. Wacht 10 s voor de pup om normale activiteit en ademhaling patroon te herstellen. Een gezonde roze tint moet verschijnen over de pup van lichaam en de kleurstof alleen zichtbaar moet zijn in het compartiment van de maag. Zet het terug naar de kooi met de andere pups.Opmerking: Gavaging blauwe voedselkleuring is een uitstekende manier om de praktijk van de hierboven beschreven procedure. Als de maagsonde succesvol is, zal de maag van de muis worden zichtbaar als een blauwe tint. Als de blauwe kleurstof wordt gevonden buiten de maag van de pup (nek, borst of axillaire regio), moet het dier worden humaan euthanized (volgens de dierenverzorgers regels), zoals dit blijkt uit een breuk van de slokdarm of aspiratie. 5. verzameling van intestional monsters voor analyse van de kolonisatie Tijdens de daaropvolgende monitoring of gavaging, fecale microbiome monsters te verzamelen van de pups.Opmerking: De pup vaak plast en kotst wanneer gavaged en ditmaal kan worden gebruikt als een kans om te verzamelen van de fecale monsters voor analyse van de microbiome. Voor beëindiging van experimenten, verzamelen de darmen vanaf de twaalfvingerige darm tot en met rectum na euthanasie van de pups. PIN van de pup een chirurgische Board en desinfecteren van de huid met 70% ethanol. De huid in vier kwadranten weggesneden zonder beschadiging van de peritoneale laag gebruik van hulpmiddelen die gesteriliseerd met 70% ethanol en een hete kraal sterilisatie bij 250 ° C. Gebruik een andere set voor steriele tools snij het buikvlies in vier kwadranten en verplaatsen van het centrum op een manier dat de viscerale organen worden blootgesteld. Zoek de maag en het gebruik van een klem om te knijpen onder de pyloric sphincter en aan het einde van de endeldarm. Voer de lengte van de darm met een botte gereedschap of pincet te stroomlijnen van de darm en het bevrijden van het bindweefsel en de mesenterische weefsel. Zodra de gehele lengte van de darm is vrijgemaakt van bindweefsel, gesneden op de geklemd uiteinden. Mark van de aluminium-folie met de oriëntatie van de darm, wikkel op een veilige manier en bevriezen bij-80 ° C.Opmerking: De DNA-extractiemethode kan worden uitgevoerd op dit punt zonder bevriezing. De blauwe kleurstof werd ook gezien de darm meer dan 24u passeren en het verzamelen van monsters voor analyse van de kolonisatie is het beste wanneer de darmen ten minste 24 uur zijn verzameld post de laatste maagsonde. Signalen kunnen worden versterkt voordat dat timepoint door de niet-naleving bacteriën Transient passeren de maagsonde mengsel. 6. DNA-extractie van darmen kolonisatie p.a. Opmerking: De DNA-extractie gebeurt met behulp van een commerciële kit met het optimaliseren van de aangebrachte wijzigingen op het protocol voor de darm DNA-extractie. Zorgen voor de kookplaat is ingesteld op de gewenste temperatuur en de oplossingen moeten verbouwingen of vooraf opwarming van de aarde op de juiste wijze zijn bereid. Voorbereiden van de enzymatische Lysis Buffer (ELB) als volgt: Maak een oplossing met 20 mM Tris-Cl, 2 mM natrium EDTA en 1,2% Triton X-100. Breng de pH op 8.0. Voeg onmiddellijk vóór gebruik ELB, lysozym aan een definitieve concentratie van 20 mg/mL. Weeg vooraf de granaat kralen buizen op analytische balans met de caps verwijderd.Opmerking: Dit is gedaan zodat als de gewenste gewicht is overschreden, is het makkelijker om te verwijderen van de intestinale inhoud. Snijd de darmen in kleine segmenten met behulp van een steriele wegwerp scalpel en schep de gewenste segmenten in de vooraf gewogen garnet kraal buizen.Opmerking: Zorg ervoor dat scalpels tussen elke sample veranderen als DNA alomtegenwoordig is en PCR-resultaten kan beïnvloeden. Voeg 1 mL ELB met lysozym (uit stap 6.1) aan elke buis, plaats op de vortexing kraal klopper en draaien op maximale instelling (14) voor 5 minuten. Zodra het weefsel wordt verstoord, de buizen overbrengen in het waterbad 37° C en incubeer gedurende 30 minuten.Opmerking: Deze stap wordt gedaan om lysozym activeren en de verdeling van de celwand van gram-positieve bacteriën peptidoglycaan induceren. Buizen met 20 µL van proteïnase K voorbereiden op elke sample bij een concentratie van 600 mAU per mL. De buizen op 400 x g gedurende 10 minuten centrifugeren. De lysate ziet er duidelijk met sommige weefsel residu op de top van de kralen. Breng 180 µL van supernatant (de bovenste fase) in een buis met proteïnase K en voeg vervolgens 200 µL van AL buffer aan de buis. Vortex voor 15 s te mengen. Plaats buizen op het blok van de verwarming bij 56 ° C gedurende 10 minuten. Voeg 200 µL ethanol 100% aan de buis en meng door de vortexing voor 15 s. Ongeveer 600 µL van lysate aan de spin kolom toevoegen (uit kit). Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8.000 x g. Stroom door negeren. Herhaal stap 6.12 totdat alle lysate is opgesteld door de kolom. Plaats de kolom in een nieuwe collectie buis. Voeg 500 µL van AW1 buffer en centrifuge op 8.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi de stroom door. Voeg 500 µL van AW2 buffer en centrifuge op 8.000 x g gedurende 3 minuten. Negeren van de stroom door en centrifugeren van de kolom in een lege collectie buis bij 8.000 x g gedurende 3 minuten. De kolom overbrengen in DNA elutie buis. Voeg 60 µL van het PCR rang ultrazuiver water rechtstreeks op het membraan en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik de voorverwarmde elutie-water bij 37 ° C te elueren. De elutie kan worden gedaan tweemaal door met behulp van de helft van het laatste elutievolume en herhalende stap 6.15 tweemaal te verhogen van de opbrengst. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8.000 x g tot Elueer DNA. Het meten van de concentratie van het DNA geëlueerd met behulp van de methode van de gewenste kwantificering. De extractie proces opbrengsten zijn in de range van 10-40 ng/µL DNA. Winkel de eluted DNA bij-20 ° C. 7. qPCR setup PCR voorwaarden Inschakelen van de machine en laadt het programma in tabel 1 in een real-time qPCR machine. Loop de stappen 3 tot en met 5 in tabel 1 voor 40 cycli en houd het monster bij 4 ° C aan het einde van de reactie. PCR experimentele opstelling Gebruik de inleidingen en de temperatuur die zijn vermeld in tabel 2. Gebruik de concentraties en de omstandigheden vermeld in tabel 3. Elke reactie in drievoud naar besturingselement voor procedurele variatie instellen. Plaats de PCR reactie buizen/plaat in het qPCR-systeem en de run het programma in het systeem van stap 7.1 geladen. Verwijderen van de buis aan het einde van de termijn, plaats het op 4 ° C en voorbereiden van gel laden. 8. kwantificering van LP kolonisatie QPCR mixen voorbereiden met 10 µL of 20 µL reacties volgens tabel 3. LP genomic DNA standaard curve 107 tot 101 kopieën/µLOpmerking: Aangezien 4 µL van elke verdunning zal worden bekleed, 107 exemplaren in 4 µL of 2.5 x 106 exemplaren per µL is vereist in de begin voorraad. Gebruik hetzelfde principe voor de rest van de curve. Maak een verdunning 1:4:107 exemplaren per µL in 50 µL.3.147 µL van LPDNA + 46.85 µL van dH2O = 2,5 x 106 exemplaren per µL Serieel verdunnen 10-fold: Voeg 5 µL op 45 µL dH2O voor 1.25 x 105 exemplaren/µL. Plaat 4 µL per verdunning per putje. Visualisatie van LP waarbij Gebruik van een 2% agarose gel te bereiken van een duidelijke scheiding van de ~ 197 bp LP versterkte fragment. Laden 9 µL van elke PCR product in de gel. Stel de gel gedurende 30 minuten bij 120 V.