Здесь мы представляем протокол руководство человека первичной простаты органоид обработки, а затем предложить конечные точки для оценки фенотип. Посева, культура обслуживания, восстановления от матрицы геля, описаны морфологической количественной оценки, внедрения и секционирование, FFPE секционирование, целом гора окрашивание и применение коммерческих анализов.
Этот документ описывает подробный протокол для трехмерных (3D) культивирование, обработки и оценки человека первичной простаты organoids. Процесс включает в себя заполнение клеток эпителия негусто в 3D матрицы геля на 96-луночных микропланшетов с изменениями СМИ культивировать экспансию organoids. Морфология затем оценивается в целом ну захвата z стека изображений. Сжатие z стеки создает единый образ в фокусе, из которого organoids измеряются для количественного определения различных мероприятий, включая округлости, округлость и области. ДНК, РНК и белка могут быть собраны из organoids оправился от матрицы геля. Клеточных популяций интерес может оцениваться органоид диссоциации и проточная цитометрия. Формалин фиксации парафин внедрение (FFPE) следуют секционирование используется для гистологической оценки и Пятнать антитела. Целом гора immunofluorescent окрашивание сохраняет органоид морфологии и облегчает наблюдение локализации протеина в organoids в situ. Коммерческих анализов, которые традиционно используются для 2D монослоя клеток могут быть изменены для 3D organoids. Используются вместе, методам в этом протоколе обеспечивают надежный инструментарий для количественной оценки роста простаты органоид, морфологические характеристики и выражение дифференциации маркеров.
Organoids являются ценным инструментом для изучения Органогенез и болезни. Они обеспечивают менее дорогой альтернативой животных моделях, и пациент производные organoids развиваются как стратегия для персонализированной медицины1,2,3. Эта система трехмерного (3D) культуры включает в себя заполнение стволовых и прогениторных клеток (из ткани или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) в гель компоненты внеклеточного матрикса (матрицы геля)4. Клетки размножаются и дифференцировать, что приводит к organotypic структур, которые пилки сотовой иерархии и морфология органа интерес в функциональной единицы. Organoids с использованием клеток, происходящих из различных органов, в том числе слюнной железы, желудка, кишечника, печени, простаты, легких и мозга4были выросли. Хотя существует множество протоколов, описывающие шаги по созданию простаты organoids5,6, это сложно найти достаточно подробную методы о том, как добиться количественного конечных точек от organoids. В этом документе обобщаются методы, разработанные для человека первичных клеток простаты и подробности ряд предлагаемых конечных точек для оценки органоид фенотипов. Эти методы были оптимизированы для простаты organoids и могут применяться в других 3D клеточных культур.
Простаты органоид культур недавно появились как ценный в vitro модель, которая не имеет ограничений монослоя культур с использованием установленных увековечен клеточных линий. Доброкачественные эпителия простаты и рака простаты является сложной задачей для модели в пробирке с помощью увековечен клеточных линий. Количество линий доброкачественных клеток ограничено, и все претерпели изменения с онкогенов7. Первичный эпителиальные клетки простаты в монослои не дифференцироваться в Люминал клетки и отсутствие андрогенных рецепторов8. Большинство линий клеток рака простаты не имеют функциональные андрогенных рецепторов, посредником значительное раннее болезненное состояние, и отсутствие ключевых генетические изменения, которые были найдены в пациента опухоли9. Простаты органоид культур можно легко выращивать из доброкачественных эпителия и ценность в изучении свойств стволовых клеток, клеток-предшественников, дифференциация и экспериментальных изменений микроокружения4,5. Рак простаты organoids можно выращивать как часть подхода медицины точности для моделирования пациента заболеваний и реагирования на терапии10.
Этот протокол был составлен из существующих протоколов, которые используют различные типы клеток, но он был оптимизирован здесь для использования в человека первичных клеток простаты. Он делал комплименты протоколы, изложенные Сойерс, Clevers и Шэнь5,6 , описывающие рост, пассированый, светлые области изображения, криоконсервация и РНК и ДНК изоляции простаты мыши и человека organoids. Целом гора протокол изменяется от Маэ и др. 11, который использовал желудочно-кишечного эпителия organoids и описывает живут изображений и замороженных и парафиновые встраивание. Borten и др. 12 описал анализ груди, толстой кишки и рака прямой кишки органоид морфологии от ярко поля изображений. Кроме того, Ричардс и др. 13 используется метод морфологической оценки простаты organoids. Наконец, Ху и др. 14 описал метод придерживаясь простаты, organoids в камере слайд на ночь перед immunofluorescent окрашивание соблюдать отдельные ячейки и дисперсия сфер для анализа потока цитометрии.
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации достаточно подробно эти технически сложные методы как один протокол, включая заполнение ячейки; средства массовой информации и матрицы геля обслуживания; Коллекция ячеек для проточной цитометрии; РНК, ДНК и белка добычу; морфологическая оценка от ярко поле z стека анализа; Встраивание, обработка и секционирование для гистологической пятнать; и всего монтаж иммунофлюоресценции или флуоресцентного зонда анализов. Биологическое значение и толкование этих различных конечных точек будет варьироваться между экспериментальный дизайн и антитела, которые используются для анализа. Путем использования этого протокола пользователи должны чувствовать себя готовы создать эксперимент с инструментарий конечных точек.
Человека первичной предстательной железы клетки эпителия (PrE) были созданы в лаборатории протоколом описан Peehl15,16 и поддерживается ограниченное количество ходов (до четырех) как описано17, но они также являются имеющиеся у коммерческих поставщиков. Гепатоцит сыворотки бесплатный медиа основанный6, на основе KSFM13и R-spondin 1-кондиционером5 СМИ публикуются как успешно произведя organoids. На основе KSFM требуется наименьшее количество добавок, поэтому это описано здесь.
Organotypic культура является захватывающей новый метод для изложив ткани с удобством обстановки в пробирке . В настоящее время лаборатории растет organoids от многих видов тканей для различных конечных точек. Методы, описанные в настоящем документе кратко полезных конечных точек и выделить новые методы полностью охарактеризовать культур 3D первичных клеток простаты.
Есть множество рецептов СМИ для выращивания простаты клеток человека первичной organoids5,6,13. Хотя все достижения жизнеспособного и сопоставимые результаты, на основе KSFM СМИ13 использует минимальный добавки так это описано здесь. Кроме того документы были опубликованы с использованием нескольких концентрации для матрицы геля, от 10% до 75% к культуре простаты organoids5,6,13. Потому что матрицы геля является дорогим реактивом, и 33% матрицы геля было показано, чтобы быть достаточно, чтобы культивировать долгосрочные (2-3 недели), жизнеспособной, unclumped organoids13, это рекомендуемая концентрация. Однако матрица гель может варьироваться в концентрации белка между много чисел, так что это должно приниматься во внимание, когда покрытие. Мы также рекомендуем приобрести матрицы геля навалом для использования через несколько экспериментов, чтобы уменьшить несоответствие между партиями. Другие лаборатории опубликовали различные форматы для покрытие матрицы геля, как капельки вместо покрытия хорошо 96-луночных плита5. Оба метода формирования жизнеспособной organoids, но формат, описанный здесь позволяет для ячеек с покрытием более редко, которое было показано, содействовать расширению клеток в больших organoids13. Однако покрытие плотности должны быть оптимизированы в зависимости от эффективности формирования конкретного пациента. Матрицы геля доступен во многих форматах, в том числе фактор роста снижение, фенола Красного бесплатно, высокая концентрация и т.д. Фактор роста снижение рекомендуется для определенных условий культуры и свободного фенола Красного рекомендуется при работе с ячейками, которые выражают GFP или в экспериментах, которые включают захват изображения z стека. Важно, что любой матрицы геля обшивка действия с ледяной реагентов, как матрица гель быстро затвердевает при комнатной температуре.
Organoids, выращиваемые в различных экспериментальных процедур может привести к изменениям в форму, поэтому светлые области изображения широко используется для изучения наблюдаемых морфологических фенотипов. Тем не менее, запись и количественного определения области или фигуры является проблемой по двум причинам: 1) систематическая во время захвата изображения и 2) трехмерный образец применения двумерных параметра как области. Одна стратегия захвата изображения – записать случайное поле и измерить определенное количество organoids в этой области, но это может создать предвзятость во время выбора, и все organoids в выбранном поле не может быть в центре внимания. Целом ну изображений, оптимизированный для 96-луночных микропланшетов формат устраняет этой погрешности выборки, собирая всю органоид населения интерес. Однако в зависимости от целей Микроскоп на руке, несколько полей может потребоваться быть собраны и плиткой для того чтобы получить образ в целом хорошо. Некоторые лаборатории описали измерительной области из одной плоскости z12, но захватить все organoids в фокусе, рекомендуется собирать и стек несколько плоскостей в единый EDF-изображения-13. В некоторых случаях мениска в матрице геля может вызвать виньетирование в изображении, и методы коррекции фона может потребоваться применить с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Точный объем идеально наиболее подходящие измерения для размера органоид; Однако это трудно точно получить, даже с несколькими изображениями z стека. Другие полезные морфологических измерения, такие как округлости и максимального/минимального соотношения, легко могут быть рассчитаны от всех organoids в целом ну EDF изображения. Вместе эти методы преодолеть выборки смещения проблемы и включить измерение параметров 2D 3D объектов в трехмерном пространстве.
Формалин фиксации и парафин встраивание organoids является распространенным методом для получения гематоксилином и эозином (H & E), иммуногистохимический (IHC) и immunofluorescent (если) пятная для визуализации и анализа6,11, 20. Однако, публикаций, которые описал эту технику отсутствуют подробные сведения о процессе внедрения. Кроме того обнаружение organoids в блоке парафин может быть сложным. Некоторые лаборатории предварительно пятно organoids с Трипановый синий до внедрения для помощи в месте при резании11. Метод, описанный здесь включает в себя использование гистологический краситель для ориентации органоид/гистология gelplug во время внедрения для повышения эффективности секционирование. H & E слайды содействовать изучению некроза, ядерной текстуры и распространением, и таким образом она должна быть обязательной конечную точку для органоид культуры для обеспечения того, чтобы клетки здоровых всей области. Сила органоид культуры является, что образцы состоят из гетерогенных смесь клеток, которые лучше напоминают в vivo пациента ткани. Например, в предстательной железе, базальную и просветный клетки присутствуют в простаты organoids5, при этом клетки, выращенных в 2D отсутствие Люминал дифференцировки8. Чтобы оценить органоид дифференциации, рекомендуется, что исследователи оценить базальной маркеры например CK5 и Р63 и просветный маркеры например андрогенных рецепторов и CK88. Любые другие экспериментальные протеинов интереса также могут быть изучены с помощью эти методы окраски.
Хотя FFPE разделы позволяют визуализации ячеек, проживающих в внутренний отсек через гистологических методов (H & E, если, ИГХ), изображения ограничены сечения, и органоид формы могут быть изменены в процессе внедрения. Целом гора окрашивание позволяет органоид витражи и наблюдается в месте, сохраняя морфологических фенотипы и разрешение изображения белка локализации. Целом монтаж представляет собой инструмент использовать пятно целом ткани или целое животное образцов, например мыши или zebrafish эмбриона и легко адаптируется для organoids. Метод, описанный здесь была изменена от процедуры Маэи др. 11, в котором детали первоначального роста и культуры желудочно-кишечного тракта organoids прямо на слайде камеры для окраски и требует фиксации всей родительской культуры. Метод конспектированный здесь включает в себя передачу одного органоид (или organoids) интерес на камере слайд во время окрашивания. Это позволяет выбор отдельных organoids для анализа состава Гора в ходе текущего эксперимента без фиксации родительской культуры. При выполнении всего гора окрашивание, необходимо оптимизировать permeabilization и время инкубации для первичных и вторичных антител для обеспечения проникновения во всем образца (везде от одного или более дней рекомендуется). После того, как образ через confocal микроскопии, 3D визуализации могут быть изготовлены для включения визуализации и локализации определенного белка и рассчитать количество положительно окрашенных клеток в образце. Проточной цитометрии является полезным конечной точкой для количественного определения населения базальной, Люминал, или стволовых клеток5,14. Чтобы сделать это, клетки оправился от матрицы геля и аккуратно отделить для окрашивания. Пользователям следует тщательно выбрать соответствующие маркеры для разделения на основе текущей литературы. Для человека первичной эпителиальных клеток простаты CD26 и CD49f являются подходящей Люминал и базальной маркеры, соответственно5,21.
Таким образом этот протокол детали роста человека первичной простаты органоид, коллекции и экспериментальной конечные точки. Следует отметить описал технику монтажа может применяться к целому ряду других анализов, которые обычно используются для 2D клеток, таких как флуоресцентный зонд на основе экспериментов, глядя на распространение19, апоптоз и внутриклеточных органелл пятна. Кроме того сбор и диссоциации метод, описанный здесь могли бы использоваться в рамках подготовки к одной клеточной РНК последовательности18. Коллективно это демонстрирует возможность для различных роман, высококачественный конечные точки, которые исследователи могут оптимизировать и изучить в будущем.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим членов МСЖД Biorespository, доктор Klara Valyi-Надя и Алекс Сюзьмы, а также урологи, Drs. Майкл Эйберн, Даниэль Морейра и Симоне Crivallero, для облегчения приобретения тканей для культур клеток первичного. Мы благодарим МСЖД урологии пациентов за пожертвования их ткани для исследования. Эта работа была, частично финансируется, Департамент из обороны простаты рак исследований программы здравоохранения неравенства идея премии PC121923 (Нонне) и МСЖД центр клинической и перевод науки Pre-doctoral образование для клинической и трансляционная ученых ( МИЧЕСКАЯ) программа (Мак-Крей и Ричардс) и национальных институтов здравоохранения Национальный институт рака, Грант номера U54CA202995, U54CA202997, и U54CA203000, известный как Чикаго здоровья справедливости совместной (Нонне и Ричардс). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здравоохранения или Министерство обороны.
Cells of interest | |||
Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
Ice Bucket | |||
Cell Culture Hood | |||
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
Centrifuge | |||
Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
Organoids | |||
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
Organoids | |||
Ice pack | |||
Masking tape | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Razor blade | |||
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
Pencil | |||
"Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
Container to hold fixative | |||
10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
Deionized water | |||
Paraffin | Leica | various | |
Tissue processor | |||
Embedding workstation | |||
Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
Microtome | |||
Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
Deionized water (DI H2O) | |||
Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
1x Phosphate Buffered Saline – PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
Confocal microscope | |||
Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
Staining dish | IHC World | M900-12B | |
Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
Organoids | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Pipette tips (200 μL) | |||
8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
Confocal microscope | |||
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
Organoids | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Pipette tips (200 μL) | |||
8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
1x Phosphate Buffered Saline – PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
Organoids | |||
Ice bucket | |||
Cell culture hood | |||
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
Microcentrifuge | |||
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
Cytokeratin 5 Antibody – FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
Cytokeratin 8 Antibody – Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
CD49f – Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
CD26 – PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |