Kullanım ve insan birincil prostat Organoid kültürü değerlendirilmesi

Aşağıdaki iletişim kuralı kullanarak insan birincil prostat epitel hücreleri, Illinois Universitesi, Chicago hastanesinde hasta dokusundan hasat optimize edildi. Bu deneyler için kullanılan tüm insan doku Protokolü edinsel üzerinden bir Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanan ve/veya muafiyet Chicago Illinois Üniversitesi’nde olduğunu. Kültür koşulları faiz hücre türüne bağlı olarak değişir iken, bitiş noktaları için diğer dokuların organoids uygulanabilir. 1. tohum epitel hücrelerinin matris jel ve Medya değiştirme Gerekli malzemeleri toplamak: insan birincil prostat epitel hücreleri (PrE), matris jel buz, 96-şey Mikroplaka, keratinosit serum-ücretsiz medya (KSFM) buz üzerinde kömür soyulmuş fetal Sığır serum (FBS) ve dihidrotestosteron (DHT). Organoid KSFM tabanlı medya KSFM 47,5 mL kömür soyulmuş FBS ve dihidrotestosteron (DHT) 2.5 mL ile birleştirerek buz son yandan 10 nM DHT, daha sonra rezerv için hazır olun. Plaka hücrelere bir 3D matris steril tekniği kullanarak bir hücre kültür Hood. Yavaşça KSFM tabanlı organoid medya ile % 50 matris elde etmek için buz gibi matris jel karışımı yavaş yavaş jel karışımı soğuk yukarı ve aşağı pipetting, kabarcıklar kaçınarak.Not: Matris jel gecede 4 ° C’de çözdürülen ve buza mümkün olan her durumda tutulması gerekir. Hızlı bir şekilde oda sıcaklığında (RT) dönüşür. % 50 matris μL jel bir 96-şey plaka üzerinde kullanılmak üzere her şey alt üzerine bir pipet ucu soğuk medya ve transfer 40-50 önceden ıslak. Temel katman oluşturmak üzere kuyunun kat.Not: Bu kabarcıklar oluşturabildiğiniz gibi tam olarak ikinci durağına pipet üzerinde dağıtmak değil. 96-şey plaka 37 ° C kuluçka temel katmanın kuvvetlendirmek 30-45 dakika yerleştirin.Not: temel katmanın üzerine epitel hücreleri katılaşmış veya hücreleri aracılığıyla matris alt plaka üzerine düşmek ve bir monolayer büyümek kadar plaka değil. Epitel hücreleri organoid KSFM tabanlı medya 100 – 1000 hücre/100 μL son bir konsantrasyon ulaşmak için matris jel ve % 33 matris jeli askıya karıştırın. Üstünde tepe-in temel katmanları iyi 100 μL % 33 matris jel/hücre karışımı kullanarak plaka epitel hücreleri.Not: Önceki deneyler göstermiştir ki tohum çok seyrek çok düşük verim13′ te neden olabilir iken epitel hücrelerinde çok yoğun 3D tohum organoid büyüme, boyutunu sınırlar. Hücre tipi hastaya özgü organoid oluşumu verimliliği üzerinde temel ilgi için tohum koşulları optimize etmek önemlidir. 30-45 dk kuvvetlendirmek matris jel izin vermek için 37 ° C kuluçka 96-şey plaka yeri, sonra yavaşça yavaşça kuyu kenarına dayanmalıdır pipetting tarafından 100 μL KSFM tabanlı organoid medya hücreleri üzerine ekleyin. Medya her 2-3 gün değiştirin. İyi tarafı karşı pipetting medya ve matris jel arasında boşluk ile dikkatli bir şekilde medya 50 μL kaldırın ve taze medya 50 μL ile değiştirin.Not: uzun vadeli bir kültür için matris jel her 2-3 hafta değiştirilmesi gerekiyor. Matris jel kültür dengesiz görünür ve mikroskop altında yarı saydam kırışıklıkları görüntüler, matris jel bozuldu ve değiştirilmesi gerekir. 2. Organoids Matrix jel üzerinden toplanması Not: Organoids topluluğu matris jel değişiklikleri, passaging veya RNA ayıklama, DNA ekstraksiyon, protein çıkarma ve akış sitometresi bitiş noktaları için gereklidir. Sıcak tarafsız proteaz ve Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 37 ° C su banyosu içinde. Dikkatli bir şekilde medya kuyulardan matris jel aksatmadan çıkarın. ~ 200 μL tarafsız proteaz olan her şey için bir ~ 1 ekleyin: matris jel: tarafsız proteaz 2 oranı ve 37 ° C’de 20 dk için kuluçkaya Mekanik matris jel: tarafsız proteaz karışımı yukarı ve aşağı pipetting tarafından ayırmak. 37 ° C’de 20 dk için kuluçkaya Tarafsız proteaz-matris hücre içi jel karışımı bir microcentrifuge tüp ya da hacmine bağlı olarak konik tüp aktarın. 300 x g hücreleri cips için 3-5 dakika için de santrifüj kapasitesi.Not: hiçbir hücre Pelet görüntülenirse, matris jel değil tamamen ayrışmış ve pembe süpernatant ayrı tüp alt yarı saydam bir aşama olarak görüntülenir. Süpernatant kaldırmak ve daha tarafsız proteaz bir 1:2 oranında matris için jel Pelet ekleyin, başka bir 20-40 dk 37 ° C’de için kuluçkaya ve 300 x gde aralıklarla tekrar. Bir organoid Pelet alındığında süpernatant kaldırın. (Bkz. Adım 2.7.1), organoid lizis RNA, DNA veya protein çıkarılması için passaging ile devam edin (bkz. Adım 2.7.2), işlem tek hücreleri akış sitometresi ve tek hücreli sıralama tarafından (bkz. Adım 2.7.3). Uzun vadeli kültür için 1,1-1,5 adımlarda açıklanan adımları izleyerek % 33 taze matris jel ve plaka sağlam organoids yavaşça resuspend. Organoids ayırmak ve tek hücre olarak replate, pelet 1 mL sıcak hücre-ayrılma enzimlerin resuspend ve 10-15 dk 37 ° C’de kuluçkaya için bir kez HBSS 5 mL ile yıkayın ve aşağıdaki adımları 1,1-1,5 taze matris jel içinde yeniden plakası. Malzemeleri tabloda listelendiği gibi uygun lizis arabelleği RNA ayıklama, DNA ekstraksiyon veya protein çıkarma organoid Pelet resuspend ve üreticinin iletişim kuralı izleyin. 1 mL sıcak hücre-ayrılma enzimlerin organoids resuspend ve 10-15 dk organoids tek kişilik hücrelere ayırmak için 37 ° C’de kuluçkaya. Bir kez HBSS 5 mL ile yıkayın ve akış sitometresi5 veya tek hücre sıralama18için protokol ile devam edin.Not: matris jel düşük konsantrasyonlarda tek hücreye ayırmak için tarafsız proteaz değil gerekli olabilir ve hücre-ayrılma enzimler doğrudan kuyuya adım 2.2 sonra uygulanabilir. 3. bütün şey resim alma ve Organoid morfoloji Analizi Bütün iyi z-yığın görüntüleri iletilen ışık ters mikroskop ile motorlu kullanarak X / Y sahne ( Şekil 1A’ resimli iş akışı) tarama. Kuyunun için ayarlanabilir odak konumu ile ilk organoid, temel katmanın üzerinden menisküs nedeniyle kuyunun Center’da olacak karşılaşılana kadar yukarı doğru odaklanarak başlar. Alt z-uçak bu konumda ayarlayın. Son organoid iyi çevre-ecek var olmak odak kadar yukarı doğru odaklanarak devam edin. En iyi z-uçak bu konumda ayarlayın.Not: z yığının altında ve üst ayarladıktan sonra bu pozisyonlar organoids tüm kalan kuyu içinde yakalamak ve üst/alt gerektiği gibi ayarlamak emin olun. Bu her organoid her şey içinde içeren tek bir tarama için kullanılacak z aralığı sağlar. 15-35 z-uçak başına iyi, daha fazla çözümleme için daha büyük bir sayı kullanarak yakalama. Tüm iyi görüntü yakalama, birleştirme ve gerekirse çeyrek daire veya alt toplamak.Not: Birden çok z-düzlem olarak karşı tek bir z-uçak, organoids odak dışında tek bir z-uçak yakalarken olan Şekil 1B adımında gösterildiği gibi almak için önerilir. Aşağı akım analiz için z-yığın görüntü kaydedin. Serbest form çizim yetenekleri ile görüntü yazılımı kullanarak görüntüleri analiz. Adım 3.1.4 ayarlayın tek bir z-uçak görüntüyü açın. Gerekirse, tek tek her z-uçakta bir tek, Bütün-da görüntü içine çekilen görüntüler döşeme. Yeni resmi ayrı bir dosya olarak kaydedin. Alınan her z-uçak için bu işlemi yineleyin. Görüntü yazılımı kullanarak, tek bir kuyudan her z-uçak için bütün iyi görüntü açın ve genişletilmiş bir alan (EDF) görüntü derinliği z-uçak yığından oluşturun.Not: Bu tür bir görüntü iyi tek bir odakta görüntü oluşturmak için her z uçak en iyi odak bölgenin seçecektir. Yazılım piksel ölçeğini ölçülür görüntü ölçek çubuğu ayarlayın. Görüntü yazılımı izleme çevre her organoid iyi ve serbest form çizim aracını kullanarak. İzlenen organoid parametreleri için ölçüm metrikleri görüntü yazılımı’nı edinebilirler.Not: Önerilen alan, Döngüsellik ve maksimum/minimum RADIUS oranı parametreleridir. Bu ölçümler uygulanması gösteren temsilcisi sonuçları Şekil 1 ciçinde gösterilir. Alan organoid’ın çevre tarafından tanımlanan Çokgen hesaplanır. Ürün reçetesinde döngü için 0 daha az dairesel, 1 daha dairesel çapı eşit bir organoid’ın en büyük gelincik, olan bir daire alanı organoid alanı oranıdır. Maksimum yarıçapı ve izlenen organoid en az yarıçapı arasındaki oran maksimum/minimum RADIUS oranıdır.Ürün reçetesinde döngü =RADIUS oranı = 4. formalin fiksasyon ve parafin Organoids histolojik bitiş noktaları katıştırma Gömme malzemeleri hazırlamak: HBSS, %2 agar çözüm, histolojik işaretleme boya, Histoloji jel, pipet ucu kalıp, teyp, pistonu 1 cc insülin şırınga, buz torbası, kaset, % 10 tarafsız tampon formalin (NBF), kalem ve % 75 histolojik grade etanol (alkol). %2 agar çözüm iki microcentrifuge Tüp hazırlayın. Bir su banyosu veya 100-110 ° C agar sıvı formda korumak için bir ısı blok üzerinde kuluçkaya. 1-2 damla histolojik boya agar üst göstermek %2 agar çözümlerden birini için işaretleme takın ve yönlendirme katıştırma sırasında korumada yardımcı ekleyin. İyice karıştırın. Sıcak su banyosu veya ısı blok 55-65 ° C’de Histoloji jel 1000 μL pipet ucu kullanarak, ~ 50 μL tutan bir silindir yapmak pipet ucu küçük bir bölümünü keserek kalıpları oluşturmak. İlk kalıp uygun ikinci, daha geniş bir kalıp oluşturun. Soğuk bir blok buz torbası bandı (yapışkan tarafı yukarı) ile kaydırma ve kalıpları teybe kalarak oluşturun. Bir dalgıç pompayı 1 cc insülin şırıngadan kaldırarak oluşturun. Organoids 2A rakamtasvir iş akışı aşağıdaki işlem, Histoloji jel fiş katıştırın. Matris jel ayırmak ve adımları 2.1-2.7 takip ederek organoids cips. Bir kez HBSS ve yeniden cips 1 mL ile organoid Pelet 300 x g de 3-5 dk iplik ve süpernatant kaldırma yıkayın. Organoid Pelet sıvı Histoloji jel 30 – 50 μL içinde yeniden askıya alma. Karışımı yavaşça yukarı ve aşağı yavaş yavaş pipetting. Histoloji jel/organoid karışımı bir kalıp içine soğuk blokta aktarmak ve serin ve bir’liğe kuvvetlendirmek numune izin. Bir dalgıç tak küçük kalıp dışarı ve daha büyük kalıp içine itmek için kullanırız. NET %2 agar büyük kalıp doldurmak için fiş çevresinde pipet. Histolojik boya renkli %2 agar üst örnek belirtmek için fiş üzerine pipet. Soğutmalı sonra bir dalgıç fişi Histoloji kaset aktarmak için kullanabilirsiniz. Bir kalem ve yer kaset % 10 kullanarak kaset etiket NBF gecede fiksasyon için. Kaset % 10 dan transfer NBF % 70 histolojik Grade alkol. İşlem Histoloji jel varsa fiş bir işlemci üzerinde önceden ayarlanmış biyopsi protokolünü kullanarak. Hazır ayar yoksa, aşağıdaki sıra ve uzunlukları giriş: % 70 alkol 6 dk, % 70 alkol 10 dk, alkol 10 dk, 10 min için alkol 2 kat, 0 alkol 3 kat 10 dk, 15 dk için 3 kez ksilen için için , ve parafin 3 kez 15 dakika süreyle sapma önerilen işlem sırasının rüptüre organoids (Şekil 3A) neden olur. Bu ilk kesitli organoids içeren renksiz kısmı sağlayacaktır Histoloji jel tak, karşı karşıya renkli kısmı ile gömebilir. Bölüm FFPE Histoloji jel blokları: Gerekli malzemeleri toplamak: FFPE Histoloji jel blok, Histoloji kalem, doku float su banyosu, buz, microtome, microtome bıçaklar, iş istasyonu, olumlu mikroskop slaytlar ve laboratuvar fırın tahsil katıştırma buz kovası. Dolgu su banyosu kadar çok tam ve küme 40 ° c, sonra önceden sıcak laboratuvar fırında 45-50 ° c Bir buz kovası hazırlamak sonra buz ile doldurun ve bir buz-su Bulamaç oluşturmak için su ekleyin. Buz blokları chill onlar are çok soğuk kadar.Not: Blok buz üzerinde 1 gün için ayarlanabilir ancak gecede bırakılırsa, bloklar sulu olmak ve reprocessed gerekir. Bir taşı microtome kaset kelepçe Ekle, bıçak bıçak tutucu ekleyin ve makinedeki herhangi bir koruyucu kilitleme önlemler kilidini. (10 µm kalınlık bakan) parafin blok yüzü çıkararak başlayın. Fiş alanı içeren bir bölümü ortaya sonra kırpma durdurun, microtome rotor kilitleme ve blok geri soğuk buz üzerine aktarın. Birkaç blok kesitli istiyorsak, face-off her blok adım 4.5.6 taşınmadan önce. Bir yeni, kullanılmamış bölümüne bıçak taşımak ve blok geri kelepçe için transfer. Makine kilidini ve bölüm başına 5 mikron, kesme başlar.Not: 5 mikron en iyi sonucu elde etmek için önerilir, ancak 3-10 mikron de kabul edilebilir. Cımbız kullanarak, bölümün 40 ° C su banyosu için transfer ve yaymak için bölümü sağlar. Bir slayda bölüm dikey olarak suya daldırma tarafından aktarın.Not: bir açıyla daldırma kabarcıklar banyo derinliklerinden bölümüne transfer ve örnek bozulma neden. Mikroskop (Şekil 2BC) bölümünde görselleştirin.Not: bir organoid Eğer mevcut, benzer şekil 2B kırmızı ok görünür. Kabarcıklar (Şekil 2B, mavi ok) organoids için benzer görünebilir ve kuru organoids yarı saydam (Şekil 2C) görüldüğü şekilde taze slaytta ayırt etmek kolaydır. Hiçbir organoids mevcutsa, daha fazla bölüme blok. Ne zaman organoids içeren slaytlar elde etmiş, Histoloji kalem ve fırında 45-50 ° C’de gecede ile slayt arka bölümüne çevresi daire Slaytlar toplamak ve H & E devam edin (bkz. Adım 4.9.1), immunohistokimyasal (bkz. Adım 4.9.2), veya immünfloresan (bkz. Adım 5) boyama.Not: Şekil 3B’ temsilcisi sonuçları gösterilir. H & E boyama gerçekleştirmek için malzeme listesinden bir kit alın ve üreticinin belirtimlerine izleyin. İmmunohistokimyasal boyama gerçekleştirmek için bir kit ve birincil antikor malzemeleri listeden alın ve üreticinin belirtimlerine izleyin. 5. immünfloresan FFPE boyama ve kesitli Organoids Malzemeleri toplamak: adım 4 pişmiş slayttan, ksilen, 0 alkol, alkol, alkol, deiyonize su (DI H2O), coplin Kavanozlar, antijen alma fosfat tamponlu çözüm (sodyum sitrat arabellek veya arabellek EDTA-Tris), serum fizyolojik (PBS), % 5 normal at serum () x 1 NHS) PBS, % 1 sığır serum albumin (BSA) raf boyama, çanak boyama, odası, hidrofobik bariyer kalem, nem odası, 1 ° ve faiz ve counterstains, 2 ° antikorlar beliriyor PBS, %0,3 non-iyonik deterjan ile %0.1 non-iyonik deterjan ile faiz. Deparaffinize ve coplins aşağıdaki çözümleri ile dolu içine daldırma slaytları rehydrate: ksilen (3 dips, 5 dk), 0 alkol (2 dips, 3 dk her), alkol (2 dips, 3 dk her), alkol (2 dips, 3 dk her) ve DI H2O (2 dips 3 dk.). Antijen alma çözüm ve ön ısı beliriyor odası ile 100 ° c ile boyama çanak doldurmak Slaytlar önceden ısıtılmış boyama çanak içine çeker tarafından antijen alma gerçekleştirmek ve 100° C’de 5-10 dk için kuluçkaya Döngüsü tamamlandıktan sonra 20 dk için kapağı açmadan önce oturup decloaking odası izin verir. Slayt çanak RT soğuduktan sonra slayt 5 min için durulama için DI H2O koşma altında boyama çanak yerleştirin. Slaytlar boyama çanak kaldırmak, hidrofobik bariyer kalemle örnek çevresinde bir daire çizin ve nem odası slaytta yattı. Örnek hidrofobik çember %5 NHS PBS %0,1 non-iyonik deterjan ile uygulayarak boyama herhangi bir non-spesifik antikor engellemek (yaklaşık 30 μL örnek kapak için gereklidir). Coplins yıkama slaytları PBS 3 kere 5 min için dolu. % 1 BSA içinde % 0,3 örnek hidrofobik çember için PBS içinde non-iyonik deterjan ile seyreltilmiş 1 ° antikorlar (Tablo reçetesi) eklemek (yaklaşık 30 μL kısmındaki kapak), 1 h RT veya gecede 4 ° C nem odasında için kuluçkaya. Slaytları PBS 3 kere 5 min için dolu coplins yıkayın. % 1 BSA içinde % 0,3 örnek hidrofobik çember için PBS içinde non-iyonik deterjan ile seyreltilmiş 2 ° antikor ekleyin (yaklaşık 30 μL alanı kapsayacak), RT nem odasında 1 h için kuluçkaya. Slaytları PBS 3 kere 5 min için dolu coplin yıkayın. O zaman karanlıkta (30 μL) RT, 2-5 min için kuluçkaya DAPI, üreticinin belirtimlerine, % 1 BSA örnek hidrofobik çember için PBS içinde % 0,3 non-iyonik deterjan ile seyreltilmiş ekleyin. Slaytları PBS 3 kere 5 min için dolu coplins yıkayın. Antifade montaj medya ve coverslip ile slaytlar monte sonra mikroskop altında sonuç görselleştirin. 6. bütün-montajı Organoids immünfloresan boyama için Malzemeleri toplamak: odası slayt veya confocal tabak, fosfat tamponlu tuz (PBS), sabitleştirici, 50 mM NH4Cl PBS, PBS, %5 NHS PBS, % 1 BSA PBS, 1 ° ve 2 ° antikorlar % 0,3 non-iyonik deterjan ile %0.1 non-iyonik deterjan ile %0.1 non-iyonik deterjan faiz ve faiz counterstains. Dikkatli bir şekilde kadar medya medya ve matris jel arasında boşluk bırakarak iyi tarafına pipetting tarafından organoid kültür aksatmadan mümkün olduğunca çıkarın. Kesilmiş, kullanarak ortam veya PBS, önceden ıslak 1.000 μL pipet ucu, bir damla kadar (25-50 μL) faiz organoid(s) içeren matris jel çizmek ve odası slayt iyi veya confocal çanak orta dağıtmak.Not: % 33 matris jel bir iyilik değil. Tam olarak ayarlı bir jöle benzer işler jelatinli bir sıvıdır. Kesilmiş pipet ucu büyük bir açılış ile kırma transferleri sırasında organoids önleyecektir. Organoids üst kültür içinde kalırsanız, ortamı sıcak KSFM tabanlı medya ile değiştirin. Çıplak gözle veya parçalanmış kapsamı ile ince uçlu pipet (10-200 μL) ile odası slayttan fazla medya ve matris jel Aspire edin.Not: Pretreat bir bağlılık reaktif odası slaytla isteğe bağlıdır. Eşit bir birim matris jel odası slaydın boş bir kuyuya autofluorescence artık matris gözlemlemek için isteğe bağlı bir denetimi olarak plaka. 30-45 dk cam için uygun ve yıkama adımları sırasında örnekleri kaybını önlemek için organoid teşvik etmek için 37 ° C kuluçka odası slayt yerleştirin. Yavaş yavaş pipetting dekolmanı slayttan önlemek, hafifçe sallayarak süre RT organoids 1 x PBS 5 min için 200 μL ile yıkayın. 1 x PBS ve hafifçe sallayarak süre düzeltme ile % 4 paraformaldehyde 30 dk az RT için 200 μL kaldırın. Matris jel bu adımdan sonra açık göründüğünden emin olun.Not: Metanol veya formalin fiksasyon da mümkün. Belirli fiksasyon yöntemlerini crosslink antijenleri ilgi veya floresan-etiketleme-proteinler ilgi yavaşlaması gibi fiksasyon yöntemi için özel antikorlar optimize edilmelidir. Sabitleştirici kaldırmak ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın.Not: adımları yıkama uzunluğu organoid boyutuna bağlı olarak optimize edilmelidir. Beş dakika yeterli bir başlangıç noktasıdır, ama çamaşır adım gerektiği gibi uzamış. Autofluorescence 50 mM NH4Cl 1 x PBS için RT, 30 dk içinde 200 μL ile hafifçe sallayarak süre gidermek.Not: Bu adımı autofluorescence organoid lümen enkaz ve deneysel tasarım takdim floresan protein ifade (örneğin, GFP) gidermek. Eğer bir fluorophore 488 kanalda kullanmak için istenen ama GFP sinyal korumak için istenirse atlanabilir dahil edilmelidir. NH4Cl çıkarın ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın. Organoids 200 μL %0,1 non-iyonik deterjan-100 1 x PBS için RT, 30 dk içinde hafifçe sallayarak süre permeabilize. %0,1 non-iyonik deterjan-100 1 x PBS ve yıkama 1 x PBS 5 min için 200 μL ile iki kez hafifçe sallayarak süre kaldırın. 200 μL %0,1 non-iyonik deterjan X-100 PBS ile %5 NHS ile engellemek ve hafifçe sallayarak süre RT, 60 dk için kuluçkaya. Engelleme arabellek kaldırmak ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın. 1 ° antikor % 0,3 ile % 1 BSA içinde seyreltik Triton X-100 1 x PBS içinde ve odası slayt 200 μL için ekleyin, sonra 1-3 gün 4 ° C’de için kuluçkaya 1 ° antikor kaldırmak ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın. 2 ° antikor % 0,3 ile % 1 BSA içinde seyreltik Triton X-100 1 x PBS içinde ve odası slayt 200 μL için ekleyin, sonra 1-3 gün içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C’de için kuluçkaya.Not: Kuluçka kez uzunluğu organoid boyut ve antikor için optimize edilmelidir. Bazı organoid nüfuz için daha fazla zaman gerektirecektir. Antikor konsantrasyon Ayrıca optimize edilmiş olması gerekir. Genel olarak, 2 x FFPE bölümleri için kullanılan toplama 1 ° antikorlar için uygundur ve FFPE bölümler için aynı toplama 2 ° antikorlar için uygundur. 2 ° antikor kaldırmak ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın. Phalloidin ile aktin ve DAPI veya Hoescht, üreticinin önerilerini içinde % 0,3 ile % 1 BSA göre seyreltilmiş çekirdekle counterstain Triton-X 1 x PBS. 200 μL odası slayda ekleyin, sonra karanlıkta 40 min için RT kuluçkaya. Taze 1 x PBS veya montaj medya 200 μL Mount ve hemen görüntü (floresan korunmalıdır 5 güne kadar olmasa bile artık bu). Temsilcisi sonuçları Şekil 3 ciçinde gösterilir.Not: Sodyum azid confocal görüntüleme hazır değilse kontaminasyonu önlemek için örnekleri eklenebilir. Temizleme Aracısı eklemek görüntüleme artırabilirsiniz. 7. bütün-Organoids deneyleri ve floresan problar için montajı Not: Ticari olarak mevcut deneyleri ve floresan problar/boyalar (örnekler üzerinde malzeme listesi dahildir) vardır yararlı bitiş noktaları19çeşitli gözlemlemek için bütün monte organoids kullanmak için iyileştirilebilir. Herhangi bir kiti bütün monte edilmiş bir örnek ile kullanmak için değiştirilebilir ancak aşağıdaki fluorescently etiketli EdU nükleer silahların yayılmasına karşı kiti için protokoldür. Dikkatli bir şekilde medya 50 μL kaldırın ve medya ve matris jel arasında boşluk bırakarak iyi tarafına pipetting tarafından EdU çözüm çalışma x 20 mikron 2 50 μL ile değiştirin. 4 ° C’de 1 – 3 gün (EdU birleşme için istenen süreyi seçim hücre türü için optimize edilmelidir) için kuluçkaya. 6.2-6,8 bir odası slayt veya confocal çanak üzerine ilgi organoids aktarmak için adımları. PBS kaldırmak ve hafifçe sallayarak süre % 3.7 paraformaldehyde RT, 30 dk için 200 μL ile düzeltin. Matrix emin jel bu adımdan sonra açık görünür. Sabitleştirici kaldırmak ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın. PBS kaldırın ve hafifçe sallayarak süre 1 x PBS için RT, 30 dk içinde %0,5 non-iyonik deterjan-100 200 μL ekleyin. 1 x floresan tepki üreticinin belirtimlerine göre kokteyl hazırlamak. %0,5 non-iyonik deterjan-100 kaldırmak ve iki kez 1 x PBS 5 min için % 3 BSA 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın. Reaksiyon kokteyl ekleyin ve RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya. Floresan tepki kokteyl ve % 3 BSA 200 μL ile bir kez yıkama 1 x PBS 5 min için hafifçe sallayarak süre kaldırın. Counterstain ve takip ederek bağlama adımları 6,21 – 6.22 (şekil 3D).