Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Atividades biológicas em última análise, são realizadas por proteínas, mais do que interagir com outras pessoas para funções biológicas. Usando uma abordagem computacional, a quantidade total de interações da proteína-proteína em humanos é estimada em 650.000 ~¹, e interrupção dessas interações muitas vezes leva a doenças². Devido a seus papéis essenciais no controle de processos celulares e organismos, inúmeros métodos foram desenvolvidos para estudar interações da proteína-proteína, tais como levedura-dois-híbrido, complementação de fluorescência bimolecular, split-luciferase complementação e co-imunoprecipitação ensaio³. Enquanto esses métodos são bons em descobrir e confirmando as interações da proteína-proteína, eles são geralmente não-quantitativos e, portanto, fornecem informações limitadas sobre a afinidade entre os parceiros de proteína interagindo. Pull-downs quantitativas podem ser usados para medir a afinidade de ligação (por exemplo, a constante de dissociação K_d), mas ele não mede a cinética da ligação, nem pode ser aplicada quando o K_d é muito baixa devido a uma insuficiente relação sinal-ruído⁴. Espectroscopia de ressonância (SPR) de plasmon de superfície quantifica a cinética de ligação, mas requer uma superfície específica e a imobilização de um reagente na superfície, o que potencialmente pode alterar a propriedade de ligação do reagente⁵. Além disso, é difícil para SPR medir Associação rápida e taxas de dissociação⁵, e não é apropriado usar SPR para caracterizar o evento de troca de subunidades de proteínas em um complexo proteico. Aqui, descrevemos um método que permite medir taxas de proteína complexa montagem e desmontagem em uma escala de tempo em milissegundos. Este método foi essencial para determinar a função de Cullin –umssociated –Nedd8 –dissociated proteína 1 (Cand1) como o F-caixa proteína troca fator^6,7.

Cand1 regula a dinâmica da E3 ligases do proteína (SCF) Skp1•Cul1•F-caixa, que pertencem à grande família de ligases do ubiquitin Cullin-anel. SCFs consistem no neddylation Cul1, que se liga a proteína de domínio de anel Rbx1, e uma proteína F-caixa intercambiável, o que recruta substratos e liga Cul1 através da proteína do adaptador Skp1⁸. Como um ligase E3, SCF catalisa a conjugação da ubiquitina de seu substrato, e é ativado quando o substrato é recrutado pela proteína F-box, e quando Cul1 é modificado pela proteína ubiquitina-como Nedd8⁹. Cand1 liga Cul1 sem modificações, e após a ligação, ele perturba tanto a associação de proteína Skp1•F-caixa com Cul1 e a conjugação de Nedd8 de Cul1^10,11,12,13. Como resultado, Cand1 parecia ser um inibidor da atividade do SCF in vitro, mas Cand1 deficiência em organismos causou defeitos que sugere um papel positivo de Cand1 na regulação de atividades SCF em vivo^{14,15,16 , 17}. este paradoxo foi finalmente explicado por um estudo quantitativo que revelou as interações dinâmicas entre Cul1, Cand1 e Skp1•F-caixa de proteína. Utilizando ensaios de transferência (FRET) de energia ressonância fluorescência que detectam a formação dos complexos SCF e Cul1•Cand1, a associação e dissociação taxa constantes (k,_na e k_fora, respectivamente) foram medido individualmente. As medições revelaram que tanto Cand1 e Skp1•F-caixa de forma extremamente apertado complexo proteico com Cul1, mas o k_fora do SCF é dramaticamente aumentado pela Cand1 e o k_fora de Cul1•Cand1 é dramaticamente aumentada por Skp1•F-caixa proteína^6,7. Estes resultados fornecem o apoio inicial e crítico para definir o papel de Cand1 como um fator de troca de proteína, que catalisa a formação de novos complexos SCF através da reciclagem de Cul1 desde os antigos complexos SCF.

Aqui, apresentamos o processo de desenvolvimento e usando o ensaio FRET para estudar a dinâmica do complexo Cul1•Cand1⁷, e o mesmo princípio pode ser aplicado para estudar a dinâmica de várias biomoléculas. TRASTE ocorre quando um doador está animado com o comprimento de onda adequado, e um aceitador com espectro de excitação sobrepondo o espectro de emissão do doador está presente dentro de uma distância de 10 a 100 Å. O estado excitado é transferido para o aceitador, desse modo diminuindo a intensidade do doador e aumentando a intensidade de aceitador¹⁸. A eficiência do traste (E) depende do raio de Förster (R₀) e a distância entre o doador e aceptor fluorophores (r) e é definida por: E = R₀⁶/ (R₀ ⁶ + r⁶). O raio de Förster (R₀) depende de alguns fatores, incluindo a orientação angular de dipolo, a sobreposição espectral do par doador-aceitador e a solução usada¹⁹. Para aplicar o traste do ensaio em um fluorímetro de fluxo parou, que monitora a mudança das emissões doador em tempo real e permite medições de rápido k,_na e k_fora, é necessário estabelecer FRET eficiente que resulta em uma redução significativa das emissões de doador. Portanto, projetar FRET eficiente, escolhendo o par apropriado de corantes fluorescentes e sites sobre as proteínas alvo para anexar as tinturas é importante e será discutido neste protocolo.